开发萜烯合酶变体的方法技术

本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞开发萜烯合酶变体的方法。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法，所述萜烯合酶变体可用于萜烯产物的商业生产。在本公开内容中另外包括优良的萜烯合酶变体和包含这样的萜烯合酶变体的宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【1.
】本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法，所述萜烯合酶变体可用于萜烯产物的商业生产。在本公开内容中另外包括优良的萜烯合酶变体和包含这样的萜烯合酶变体的宿主细胞。【2.
技术介绍
】萜类是在许多生物中产生的一大类烃。它们通过连接异戊二烯(C5H8)单元而衍生出，并且根据存在的异戊二烯单元的数目来分类。半萜由单个异戊二烯单元组成。异戊二烯自身被视作唯一的半萜。单萜由2个异戊二烯单元构成，且具有分子式CltlH1615单萜的例子是香叶醇、柠檬烯和松油醇。倍半萜由3个异戊二烯单元组成，且具有分子式C15H2415倍半萜的例子是金合欢烯、法尼醇和广藿香醇。二萜由4个异戊二烯单元构成，且具有分子式C2(iH32。二萜的例子是咖啡醇、咖啡白脂、西柏烯和紫杉二烯。二倍半萜由5个异戊二烯单元构成，且具有分子SC25H4tl。二倍半萜的一个例子是香叶基法尼醇。三萜由6个异戊二烯单元组成，且具有分子式C3tlH4815四萜含有8个异戊二烯单元，且具有分子式C4(iH64。生物学上重要的四萜包括无环的番茄红素、单环的Y-胡萝卜素和二环的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。多萜由许多异戊二烯单元的长链组成。天然橡胶由其中双键为顺式的聚异戊二烯组成。当萜类经过化学改性(例如，通过氧化或碳骨架的重排)时，得到的化合物通常被称作萜类化合物，其也被称作类异戊二烯。类异戊二烯起许多重要的生物学作用，例如，作为电子传递链中的醌，作为膜组分，通过蛋白质异戊二烯化在亚细胞靶向和调节中起作用，作为光合色素(包括类胡萝卜素、叶绿素)，作为激素和辅因子，和作为植物防御化合物(利用不同的单萜、倍半萜和二萜 )。它们在工业上可用作抗生素、激素、抗癌药物、杀虫剂和化学试剂。通过异戊烯基焦磷酸(异戊烯基二磷酸或IPP)和它的异构体二甲基烯丙基焦磷酸(二甲基烯丙基二磷酸或DMAPP)的缩合，生物合成萜类。已知2个产生IPP和DMAPP的途径，即真核生物的甲羟戊酸依赖性的(MEV)途径和原核生物的独立于甲羟戊酸的途径或脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途径。植物利用MEV途径和DXP途径。IPP和DMAPP又通过异戊二烯基二磷酸合酶(例如，分别为GPP合酶、FPP合酶和GGPP合酶)的作用而缩合成聚异戊二烯基二磷酸(例如，香叶基二磷酸或GPP、法呢基二磷酸或FPP、和香叶基香叶基二磷酸或GGPP)。聚异戊二烯基二磷酸中间体被萜烯合酶转化成更复杂的类异戊二烯结构。萜烯合酶属于形成多种产物的大基因家族。萜烯合酶的例子包括倍半萜合酶，其将FPP转化成倍半萜。倍半萜合酶的一个例子是金合欢烯合酶，其将FPP转化成金合欢烯。已经广泛地研究并充分地理解了萜烯合酶的反应机理。总体上，需要3个步骤才能将二磷酸底物诸如FPP转化成它的类异戊二烯产物:a)形成酶-底物复合物(ES)，b)形成酶-结合的反应性的碳阳离子中间体，随后重排，并形成产物(EP)，和c)从酶-产物复合物释放出产物。对萜烯合酶催化的反应的体外动力学和前稳态动力学研究已经证实，所述反应的总限速步骤是产物的释放(Cane 等人.(1997)Biochemistry, 36(27):8332-9,和 Mathis 等人.(1997)Biochemistry 36(27):8340-8)。職烯合酶的周转率较低,通常在小于0.5s-1测得(Cane, D.C.(1990)Chem.Rev.90:1089-1103)。萜烯合酶在通向类异戊二烯的途径通量的调节中是重要的，因为它们在代谢分支点起作用，并经常与其它代谢酶竞争异戊二烯基二磷酸库。例如，FPP是许多细胞分子(包括角鲨烯、多萜醇和辅因子血红素)的前体。在希望在其中生产倍半萜(诸如金合欢烯)的经工程改造的微生物中，萜烯合酶在这类萜的高产量生产中起关键作用。但是，因为它们是慢速酶，萜烯合酶经常是代谢途径的瓶颈。另外，它们可能具有其它缺点，诸如底物抑制，所述底物抑制会限制在经工程改造的微生物宿主中有效地生产萜类所需的动力学能力(Crock等人.(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 94:12833-12838)。 因此，提高萜烯合酶的催化效率使得这些酶不再限制通向类异戊二烯的总代谢通量，具有潜在巨大的益处。以前已经描述了为改变的产物特异性而工程改造萜烯合酶的尝试以及合理方案(诸如基于结构引导或适应进化的那些)的应用(Greenhagen等人.(2006)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 103:9826-9831;O’ Maille 等人.(2008)Nat.Chem.Biol.4:617-623; Yoshikuni 等人.(2006) Nature 440:1078-1082; Yoshikuni 等人.(2008)Chem.Biol.15:607-618)。但是，这些研究没有在维持萜烯合酶的产物特异性的同时也提高萜烯合酶的动力学能力。另外，常规蛋白质工程策略(诸如定向进化)的应用已经回避了萜烯合酶，主要因为缺少可利用的且有效的高通量筛选方法(Yoshikuni等人.(2008)(出处同上))。因此，需要用于提高萜烯合酶的催化效率的可靠的高通量方法，以及具有这样的提高的催化效率的萜烯合酶变体。【3.
技术实现思路
】本公开内容涉及通过经工程改造的宿主细胞。具体地，本公开内容提供了开发具有提高的体内性能的萜烯合酶变体的方法。所述方法也允许连续提高这些酶的体内性能。在一个方面，本专利技术提供了具有提高的体内性能的倍半萜合酶变体的筛选方法，所述方法包括下述步骤:a)将表达对照倍半萜合酶的宿主细胞工程改造成包含高水平的FPP，其中与不包含高水平的FPP的亲本细胞相比，所述高水平的FPP会降低宿主细胞的生存力；b)在所述宿主细胞中表达试验倍半萜合酶而不是对照倍半萜合酶，其中所述试验倍半萜合酶是对照倍半萜合酶的变体；和c)通过与表达对照萜烯合酶的宿主细胞相比表达试验倍半萜合酶的宿主细胞的生存力增加，将试验倍半萜合酶鉴别为具有与对照倍半萜合酶相比提高的体内性能。在某些实施方案中，将宿主细胞铺板在琼脂平板上，并通过菌落生长来鉴别包含具有提高的体内性能的试验萜烯合酶变体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述方法进一步包括选择和/或分离具有提高的体内性能的试验倍半萜合酶。在某些实施方案中，在宿主细胞集合中表达倍半萜合酶变体集合。在某些实施方案中，所述倍半萜合酶变体集合包含2-5、5-10、10-50、50-100、100-500、500-1，000、I, 000-10，000、10，000-100，000、100，000-1，000，000、和更多种倍半萜合酶变体。在某些实施方案中，以迭代方式使用筛选方法，其中在一个迭代中鉴别出的试验倍半萜合酶用作下一个迭代的对照倍半萜合酶，且其中在一个迭代中的宿主细胞包含如此高水平的FPP:在有在前一个迭代中鉴别出的试验倍半萜合酶存在下，与不包含高水平的FPP的亲本细胞相比，所述宿主细胞具有降低的生存力。在另一个方面，本文提供了包含2个细胞亚群的组合物，所述细胞亚群源自共同的包含高水平的FPP的宿主细胞群，其中:a)第一亚群包含对照倍半萜合酶，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种试验萜烯合酶变体的提高的体内性能的方法，所述方法包括下述步骤：（a）将宿主细胞群分成对照群和试验群；（b）在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；（c）在所述试验群中表达试验萜烯合酶和所述对比萜烯合酶，其中所述试验萜烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在所述试验群中和在所述对照群中以类似的水平表达；和（d）在所述试验群中和在所述对照群中测量所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.02 US 61/438,9481.一种试验萜烯合酶变体的提高的体内性能的方法，所述方法包括下述步骤:Ca)将宿主细胞群分成对照群和试验群；(b)在所述对照群中表达对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中所述对比萜烯合酶能够将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；(c)在所述试验群中表达试验職烯合酶和所述对比職烯合酶，其中所述试验職烯合酶是所述对照萜烯合酶的变体，且其中所述对比萜烯合酶在所述试验群中和在所述对照群中以类似的水平表达；和(d)在所述试验群中和在所述对照群中测量所述第一萜烯与所述第二萜烯之比。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述试验群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比相对于所述对照群中的所述第一萜烯与所述第二萜烯之比的增加，将所述试验群鉴别为包含萜烯合酶变体，所述萜烯合酶变体具有比所述对照萜烯合酶提高的体内性能。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是倍半萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是法呢基二磷酸(FPP)。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述对比萜烯合酶是曲古二烯合酶。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和试验萜烯合酶是具有金合欢烯合酶活性的合酶。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶、对比萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是单萜合酶，且所述聚异戊二烯基二磷酸是香叶基二磷酸(GPP)。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞包含MEV途径的一种或多种异源酶。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述MEV途径的一种或多种异源酶选自:ERG8、ERG10、ERG12、ERG13、ERG19 和 HMGl。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述试验萜烯合酶与所述对照萜烯合酶相差1-10个氨基酸。10.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一萜烯与所述第二萜烯之比是至少1.3。11.根据权利要求1所述的方法，其中试验萜烯合酶在所述试验群中的表达水平与所述对照萜烯合酶在所述对照群中的表达水平类似。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照萜烯合酶和所述试验萜烯合酶是相同的，但是在所述对照群和所述试验群中以不同的水平表达。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞群是酵母细胞群。14.一种包含2个细胞亚群的组合物，所述2个细胞亚群源自共同的宿主细胞群，其中:(a)所述第一亚群包含对照萜烯合酶和对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第一萜烯，且其中对比倍半萜合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化成第二萜烯；(b)所述第二亚群包含试验萜烯合酶和所述对比萜烯合酶，其中所述对照萜烯合酶将聚异戊二烯基二磷酸转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立山，徐岚，P·韦斯特法尔，A·迈恩，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：
国别省市：