本发明专利技术公开了一种基于抗原特异性TNF-α-ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用，该试剂盒包括：包被TNF-α抗体的酶标板、TNF-α蛋白标准品、ESAT-6和CFP-10的蛋白液、生物素标记TNF-α抗体和亲和素标记的辣根过氧化物酶。本发明专利技术应用基于TNF-α-ELISA检测活动性结核病的试剂盒，可以建立一种区分活动性与潜伏性结核感染的方法，通过ELISA技术定量检测结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激条件下外周血单个核细胞释放的TNF-α，以及非刺激情况下外周血单个核细胞释放的本底TNF-α，通过以上两者相减得到抗原特异性TNF-α值，从而对活动性结核病进行直接诊断。
【技术实现步骤摘要】
基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用
本专利技术涉及ELISA试剂盒应用领域，具体地指一种基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用。
技术介绍
结核是威胁人类健康的重大疾病之一，主要引起肺部疾病，其发病率和死亡率均居高不下。历史上，结核病曾在世界上广泛流行，数亿人被夺走生命。20世纪50年代以来，抗结核药物不断被发现，使结核病的流行得到了一定的控制。近年来，由于有些国家对结核病防治工作的忽视，加上流动人口增加、艾滋病感染者的传播以及耐药结核菌株不断出现等因素，使结核病流行有所回升。目前全世界每年新增病例800万，每年有200万人死于结核菌感染。因此，世界卫生组织已宣布进入“全球结核病紧急状态”，并将每年的3月24日定为“世界防治结核病日”。面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗是结核病防治工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多数医院根据直接涂片镜检和结核分枝杆菌培养技术对活动性结核进行诊断。结核菌涂片检查虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。结核菌培养检测结果可信度高，但耗时较长，不能满足临床需求。此外，结核菌素皮试(pro)实验是目前国内诊断结核菌感染的主要依据。此法简单易行且费用低，但是其最大缺点在于pro试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物，和许多非结核分枝杆菌及卡介苗(BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊断特异性差。中国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成pro实验假阳性率很高，所以临床上只能根据pro实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。细胞免疫介导的结核菌Y -干扰素(Y -1FN)释放试验是近年来采用酶联免疫吸附法(ELISA)或酶联免疫斑点法(ELISpot)，通过定量检测受检者外周血单个核细胞在结核分枝杆菌特异抗原刺激下释放的Y-1FN，从而对潜伏和活动性结核感染进行诊断。该方法原理为Thl型分泌因子Y-1FN与体内结核菌抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再次遇到同类抗原时能产生高水平的Y -1FN,因此被用于结核感染的诊断。根据此原理，英国牛津免疫技术公司已研发出TSPOT-TB结核感染诊断试剂盒，该试剂盒应用结核菌特异性抗原早期抗原靶6 (ESAT-6)、培养滤液蛋白10 (CFP-10)刺激受检者外周血中单个核细胞，通过检测Y-1FN水平从而对结核感染进行诊断。该实验不受BCG及非结核分枝杆菌影响，且其检测灵敏度和特异性均高。遗憾的是，基于Y-干扰素释放试验的方法虽然能对结核分枝杆菌感染进行快速诊断，但该方法却不能用于区分活动性与潜伏性结核感染。活动性结核患者应尽早给予治疗。然而，中国是结核病大国，存在大量的潜伏性结核感染者，这类潜伏性结核感染人群可能终生都没有临床症状，也不需要进行任何治疗。由于Y-干扰素释放试验的高灵敏性，除了活动性结核感染者之外，应用此方法检测潜伏性结核感染者也均为阳性，因此给临床用药带来困难。此也为Y-干扰素释放试验进行结核诊断在中国难以推广的重要原因。如果能开发出只有活动性结核患者才表现为阳性，而潜伏性结核患者表现为阴性的检测方法，将对我国结核病诊断及治疗具有重要意义。目前，国内还未开发出用于活动性结核病诊断的同类产品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题就是提供了一种基于抗原特异性TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒及其应用，该试剂盒通过ELISA技术检测受检者外周血单个核细胞在不同刺激下分泌的TNF- α水平，从而计算抗原特异性TNF- α值。为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种基于TNF- a -ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒包括:I)包被TNF- α抗体的酶标板；2 ) TNF- α蛋白标准品；3) ESAT-6 和 CFP-10 的蛋白液；4 )生物素标记TNF- α抗体。进一步地，所述试剂盒还包括PBS浓缩洗涤液、植物血凝素、底物液和终止液中任意一种或几种。再进一步地，所述ESAT-6和CFP-10的蛋白液浓度均为10 μ g/ml。再进一步地，所述试剂盒还包括亲和素标记的辣根过氧化物酶。本专利技术还提供了所述的试剂盒在检测活动性结核病中的应用，包括以下步骤:I)向收集得到的受检者外周血单个核细胞悬液中加入ESAT-6和CFP-10的蛋白液，进行诱导，阴性对照为向受检查者外周血单个核细胞的培养液中加入培养液进行诱导，用于检测本底TNF-α水平；2)在37°C、5%C02的培养箱中培养16?20小时，收集培养液的上清；3)采用ELISA技术检测培养液上清中各孔TNF- α浓度；4)计算抗原特异性TNF- α值:外周血单个核细胞在结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10刺激下分泌的TNF-α水平减去本底TNF-α水平；5)根据抗原特异性TNF- α值大小判断患者是否存在活动性结核感染。.作为优选方案，试剂盒在检测活动性结核病中的应用，包括以下步骤:I)在普通96孔反应板的四个孔内加入100 μ I待测的外周血单个核细胞悬液；2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50μ I培养液；阳性对照孔加Λ 50 μ I植物血凝素；两个检测孔分别加入50 μ I的ESAT-6蛋白液和50 μ I的CFP-10蛋白液；3)将96孔板置于37°C、5%C02的培养箱中培养16?20小时；4)取出步骤3)中的96孔板，收集各孔培养液上清；5)将TNF-α蛋白标准品用PBS洗涤液溶解后进行倍比稀释:800pg/ml、400pg/ml、200pg/ml> 100pg/ml>50pg/ml 和 25pg/ml 六个浓度梯度；6)分别取100 μ I步骤4)得到培养液上清和步骤5)得到六个浓度梯度的溶液，分别加入包被TNF-a抗体的酶标板的孔内，空白对照孔加入100μ I的PBS洗涤液；继续在以上各孔中分别加入50 μ I生物素标记TNF- α抗体；7)将包被TNF- α抗体的酶标板置于37°C条件下孵育90分钟；8)取出包被TNF- α抗体的酶标板，弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；9)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的亲和素辣根过氧化物酶结合物；将酶标板置于37°C条件下孵育30分钟；10)取出酶标板弃上清液，加入250?300 μ I的PBS洗涤液2?3次，最后一次将酶标板在滤纸上拍干；11)向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的底物液，避光条件下室温孵育10?30分钟；12)再向对应的酶标板孔内分别加入100 μ I的终止液，10分钟内通过酶标仪检测450nm处吸光值；13)通过TNF-α标准品各浓度和吸光值绘制标准曲线，并将各检测样本吸光值通过标准曲线换算成各检测样本TNF-a浓度。本专利技术原理:本专利技术根据结核感染患者体内特异性效应细胞再次受到结核抗原诱导时可迅速活化，并大量分泌炎性细胞因子TNF-a (肿瘤坏死因子-a )，且结核特异性TNF-α分泌在潜伏和活动性结核感染患者中存在显著差异。所以，和Y-干扰素释放试验相比，针对检测抗原特异性TNF-a的方法，在区分潜伏本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于抗原特异性TNF?α?ELISA检测活动性结核病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：?1）包被TNF?α抗体的酶标板；?2）TNF?α蛋白标准品；?3）ESAT?6和CFP?10的蛋白液；?4）生物素标记的TNF?α抗体。
【技术特征摘要】
1.一种基于抗原特异性TNF-a-ELISA检测活动性结核病的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括:1)包被TNF-α抗体的酶标板；2)TNF-α蛋白标准品；3)ESAT-6和CFP-10的蛋白液；4)生物素标记的TNF-α抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括浓缩PBS洗涤液、植物血凝素、底物液和终止液中任意一种或几种。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述ESAT-6和CFP-10的蛋白液浓度均为10 μ g/mlo4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述亲和性的标记物为辣根过氧化物酶。5.权利要求1~4任意一项所述的试剂盒在检测活动性结核病中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:包括以下步骤:O向收集得到的受检者外周血单个核细胞悬液中加入ESAT-6和CFP-10的蛋白液，进行诱导，阴性对照为向受检查者外周血单个核细胞的培养液中加入培养液进行诱导；2)在37°C、5%C02的培养箱中培养16~20小时，收集培养液的上清；3)采用ELISA技术检测培养液上清中各孔TNF-α浓度；4)计算抗原特异性TNF-α值:外周血单个核细胞在结核分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP-10刺激下分泌的TNF-α水平减去本底TNF-α水平；5)根据抗原特异性TNF-α值大小判断患者是否存在活动性结核感染。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于:包括以下步骤:.1)在普通96孔反应板的四个孔内加入100μ I待测的外周血单个核细胞悬液；.2)在上述四个孔中加入如下试剂:阴性对照孔加入50μ I培养液；阳性对照孔加入.50 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙自镛，汪峰，侯红艳，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：
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