用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法技术方案

本发明专利技术涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本发明专利技术还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面面积(≤5毫米)和具有多个结合分子和多个荧光标记的探针梢端。通过水平流动反应溶液并且在反应容器中上下移动该探针梢端加速该结合反应。本发明专利技术还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联Ficoll分子。

【技术实现步骤摘要】
用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法分案声明本申请是2010年3月2日提交的申请号为201080010177.X、专利技术名称为“用于高灵敏度荧光分析的检测系统和方法”的中国专利申请的分案申请。
本专利技术涉及在荧光分析中用于测量荧光信号的检测系统。该系统包括探针，其具有结合有荧光标记的传感表面，以及安装在衬底传感表面的近侧的光源和检测器。本专利技术还涉及用于在液体样品中检测被分析物的方法，其使用具有小表面的探针和具有多个结合分子及多个荧光标记的聚合物。本专利技术还涉及一种荧光标记组合物，其包括具有多个结合分子和多个荧光标记的交联多糖主链分子。
技术介绍
在免疫分析系统的研制中，需要满足许多性能要求。分析需要足够灵敏，以在亚皮克毫微克范围的极低水平下检测被分析物。总的分析时间需要为15分钟或更少，以在护理情形下提供及时的结果用于病人管理，或满足批量分析者的处理量需要。在一些情况下，同时用相同的样品进行多重分析的被分析物面板是有利的，以最小化结果的周转时间和测试成本。许多免疫分析使用荧光标记，因为这类标记有许多实用性的优点。和酶相比，荧光标记稳定得多，并且不需要其它底物试剂。对于多重分析面板，由于每个结合区域可以依次经受荧光激发和放射测量，不受相邻的结合区域干扰，荧光标记可以在同一反应室中使用离散的结合区域。然而，采用荧光标记的分析灵敏度低于基于酶的分析，这主要是由于酶能够催化转化底物，以随着时间的推移积聚大量的产物分子。芳基磺酸酯花青荧光染料被描述于Mujumdar等(1993)BioconjugateChemistry，4∶105-111；Southwick等(1990)Cytometry，11∶418-430；和美国专利号5,268,486。每一篇参考文献都描述了Cy5，并且其可以从宾夕法尼亚州匹兹堡的BiologicalDetectionSystems公司买到，商品名为FluorolinkTMCy5TM。该芳基磺酸酯花青荧光染料具有高消光系数(通常为130,000升/摩尔至250,000升/摩尔)，优良的量子产率，在大多数生物材料和塑料的自体荧光波长范围以外(500纳米至750纳米)的荧光发射谱，优良的溶解性，以及低非特异性结合特性。尽管有这些优异性能，芳基磺酸酯花青荧光染料也存在某些限制。特别是，这些染料的斯托克斯频移相对较窄，其导致该染料的激发和发射谱之间的明显重叠。当这些染料分子在受激发时彼此位置接近时，该激发和发射谱的重叠可以引起荧光的自熄灭。这种自熄灭限制了可以结合至单个抗体分子用于免疫分析的芳基磺酸酯染料分子的数目。在示范性的芳基磺酸酯花青荧光染料Cy5的情况下，斯托克斯频移是17纳米(其为650纳米的激发波长和667纳米的发射波长之差)。当两至四个Cy5分子被结合至单个抗体分子时，获得最佳的荧光产率。当超过四个染料分子被结合至单一抗体分子时，该荧光信号输出迅速下降。这种不能结合超过四个染料分子至单一的抗体分子的特性明显限制了使用Cy5-标记的抗体及其它结合物质的免疫分析的灵敏度。需要有改善的光学探测系统和改善的方法，用于通过荧光免疫分析以高灵敏度检测被分析物。该系统和方法应易于由用户操作，并提供高特异性的信号和最小的背景噪声。
技术实现思路
概述本专利技术涉及一种荧光检测系统，其用于测量探针梢端上的荧光信号。该系统包括：(a)长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；(b)用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；(c)指向该传感表面的会聚透镜；和(d)用于检测该发射荧光的光学探测器；其中该会聚透镜会聚该发射荧光并将其引导至该光学探测器。本专利技术还涉及用于通过荧光免疫分析检测被分析物的方法。在一个实施方式中(三步结合)，该方法包括步骤：(a)获得一探针，其具有被固定在该探针梢端上的第一抗体，其中该梢端表面的直径≤5毫米；(b)将该探针梢端浸入包含具有被分析物的样品溶液的样品容器中，在该样品容器中上下移动该探针梢端并水平流动该样品溶液；(c)将该探针梢端浸入包含试剂溶液的试剂容器，该试剂溶液包括和一结合配对的第一成员结合的第二抗体分子，在该试剂容器中上下移动该探针梢端并水平流动该试剂溶液；(d)将该探针梢端浸入含洗液的洗涤容器中；(e)将该探针梢端浸入含有扩增溶液的扩增容器中，该扩增溶液包括分子量至少为约一百万道尔顿，并且和该结合配对的第二成员的至少5个分子和至少25个荧光标记结合的聚合物，在该扩增容器中上下移动该探针梢端并水平流动该扩增溶液，以在该探针梢端上形成该被分析物，该第一抗体，该第二抗体，以及该结合配对的第一和第二成员间的免疫复合体；(f)将该探针梢端浸入含第二洗液的第二洗涤容器；和(g)通过检测该探针梢端上的荧光信号检测所形成的免疫复合体；其中该第一抗体和该第二抗体是针对该被分析物的抗体。本专利技术的方法实现了高灵敏度，这是由于独特地组合了(i)采用具有小传感表面面积的用于结合被分析物分子的探针，(ii)在反应容器中上下移动该探针梢端并水平流动该反应溶液，和(iii)采用和多重结合分子和多重荧光标记结合的高分子量聚合物。本专利技术还涉及荧光标记组合物，其包括：(a)分子量至少一百万道尔顿的交联Ficoll，(b)至少5个结合分子，和(c)至少25个荧光染料分子，其中这些结合分子和荧光染料分子附着于该交联Ficoll。附图说明图1显示了该光学探测系统的第一实施方式。图2显示了该光学探测系统的第二实施方式。图3显示了该光学探测系统的第三实施方式。图4显示了该光学探测系统的第四实施方式。图5显示了该光学探测系统的第五实施方式。图6显示了该光学探测系统的第六实施方式。图7显示了用于检测被分析物的两步结合方法。图8显示了一光学检测系统，其中光源和检测器两者均被安装在该探针的传感表面的相对侧。图9显示了该光学检测系统的另一视图，其中该探针被浸入被分析物溶液。图10显示了制备交联Ficoll400的流程图。图11显示了制备Cy5-抗体-交联Ficoll400的流程图。图12显示了通过Sepharose4BCL色层分离法进行的SPDP标记的交联Ficoll400的洗脱图形。图13显示了用于检测A蛋白的免疫分析形式。Ab：抗体，Ag：抗原(A蛋白)，Sa：链霉亲和素，B：生物素，F：荧光标记。详细说明定义除非在下文定义，权利要求和说明书中使用的术语将根据本领域技术人员所理解的通常含义进行解释。此处使用的“约”指在所列举值的±15％以内。此处使用的“被分析物结合”分子指能参与和被分析物分子的特异性结合反应的任何分子。其实例包括，但不限于，(i)抗原分子，其用于检测特异性针对该抗原的抗体的存在；(ii)抗体分子，其用于检测抗原的存在；(iii)蛋白质分子，其用于检测该蛋白质的结合配偶体的存在；(iv)配位体，其用于检测结合配偶体的存在；或(v)单链核酸分子，其用于检测核酸结合分子的存在。形状的的“纵横比”指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。“结合分子”指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。此处使用的“结合配对”指彼此吸引并特异性结合的两个分子。结合配对的例子包括，但不限于，抗原和针对该抗原的抗体，配位体及其受体，核酸的互补链，生物素和抗生物素蛋白，生物素和链霉亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在荧光分析中测量荧光信号的检测系统，包括：长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；朝向该传感表面的会聚透镜；和用于检测该发射荧光的光学探测器；其中这些会聚透镜会聚此发射荧光并将其引导至该光学探测器。

【技术特征摘要】
2009.03.03 US 61/209,116;2010.01.29 US 61/299,5251.用于在荧光分析中测量荧光信号的检测系统，包括：长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面，其中所述荧光标记包括分子量至少为一百万道尔顿、并且结合了至少5个结合分子和至少25个荧光染料分子的交联Ficoll；用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；朝向该传感表面的会聚透镜；和用于检测该发射荧光的光学探测器；其中这些会聚透镜会聚此发射荧光并将其引导至该光学探测器。2.根据权利要求1的系统，其中该探针近端表面的直径等于或小于5毫米。3.根据权利要求1的系统，其中该探针是透明的。4.根据权利要求3的系统，其中该探针的远端是锥形和/或粗糙的，以减少不希望的反射。5.用于在荧光分析中测量荧光信号的检测系统，包括：长度比宽度的纵横比至少为5比1的透明探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；朝向该传感表面的会聚透镜；和用于检测发射荧光的光学探测器；其中这些会聚透镜会聚此发射荧光并将其引导至该光学探测器；其中该光源被对准，以使该光束以大于此探针的数值孔径角度的入射角投射在该近端表面上。6.用于在荧光分析中测量荧光信号的检测系统，包括：长度比宽度的纵横比至少为5比1的探针，该探针具有远端和近端，该近端具有和荧光标记结合的传感表面；用于直接发射激发光至该探针的传感表面的光源；朝向该传感表面的会聚透镜；和用...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭洪，罗伯特·F·祖克，谭玉山，曹二华，夏明，陈骏，
申请(专利权)人：万迈医疗仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：