决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法；该基因核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1；克隆步骤包括：决明总RNA提取和反转录；3′-RACE和5′-RACE扩增；决明ICS基因全长cDNA序列扩增；PCR产物的克隆纯化与筛选。本发明专利技术方法首次获得决明SoICS基因的全序列，同时通过一种克隆决明SoICS基因的引物组和克隆方法，它能快速准确地克隆决明SoICS基因的全序列，为后续决明SoICS基因分子研究提供了理论基础。

【技术实现步骤摘要】
决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法
本专利技术涉及生物
，尤其是决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法。
技术介绍
决明为小品种中药材，在我国资源丰富，决明子不仅具有广泛的药用价值，而且还是很好的保健食品原料，属中华人民共和国卫生部规定的食药同源的药材之一。蒽醌类化合物是地球上最丰富的天然醌类物质，有着重要的药用价值和工业价值。它是中药决明子及许多其它中药材（如大黄、虎杖、何首乌等）的主要药用成分之一。据报道，异分支酸合酶（Isochorismatesynthase,ICS）是从莽草酸途径向合成蒽醌和水杨酸两个分支途径的一个关键酶，其活性控制着分支酸向此两个分支途径的流量，ICS是水杨酸和蒽醌类化合物合成的限速酶。在枯草杆菌、绿脓杆菌和大肠细菌中有关ICS的研究较多。植物中ICS的研究相对滞后，在拟南芥中有较详细的研究，在茜草、诺丽、杨属植物、长春花等植物中也有报道。目前还没有决明SoICS基因相关报道，克隆决明SoICS基因的全序列是相当有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种决明SoICS基因、用于克隆植物SoICS基因的引物及其克隆该方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种决明SoICS基因，该基因核苷酸序列为SEQIDNO：1。进一步：所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQIDNO：2。一种用于克隆决明SoICS基因的引物组，所述引物组序列如下：ICS3-15′-GTTTGTGGG(T/C)TTCCA(A/G)CAGAAG-3′GeneRacer3′P5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′ICS3-25′-TATGC(T/G)GGGACAGGGATAGT-3′GeneRacer3′NP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ICS5-15′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA-3′ClontechUPM5′-GAGCAACTTGGTGAACTGAG-3′ICS5-25′-GAGTTCTAGCTCATCCCACTC-3′ClontechNUP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′FsoICS3S5′-ATGGCAACCGGAGCTGCACACA-3′RsoICS3S5′-ATTGATGGTGCTCAATGCTCATATACAGTC-3′。一种克隆决明SoICS基因的方法，包括如下步骤步骤一、决明总RNA提取和反转录；步骤二、3′-RACE和5′-RACE扩增；步骤三、决明ICS基因全长cDNA序列扩增；步骤四、PCR产物的克隆纯化与筛选。进一步的：所述步骤二中3′-RACE和5′-RACE扩增包括如下步骤：A、决明ICS基因cDNA的3′末端一扩反应使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacerKit提供的GeneRacer3′P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进行3′末端一扩反应；扩增体系为ddH2O17.25μl，10×buffer2.5μl，dNTP(10mmolL-1)0.5μl，MgCl2（25mmolL-1）1.5μl，3′P（10μmolL-1）0.5μl,ICS3-1(10μmolL-1)0.5μl，总cDNA0.5μl，Taq聚合酶（5Uμl-1）0.25μl，总体积25μl；扩增程序为：94℃2min，94℃1min，56℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min；B、决明ICS基因cDNA的3′末端巢扩反应使用基因特异引物ICS3-2和GeneRacerKit提供的物GeneRacer3′NP为引物对，以0.5μl3′-RACE一扩产物作为模板，进行决明ICS基因的3′末端巢扩反应，反应体系和扩增程序同一扩；C、决明ICS基因cDNA的5′末端一扩反应使用5′RACE基因特异引物ICS5-1与SMARTTMRACE试剂盒提供的引物ClontechUPM为引物对，用总cDNA为模板，进行5′端一扩反应，扩增体系为ddH2O17.25μl，10×buffer2.5μl，dNTP（10mmolL-1）0.5μl，MgCl2（25mmolL-1）1.5μl，UMP（10μmolL-1）0.5μl,ICS5-1(10μmolL-1)0.5μl，3′RACEcDNA0.5μl，Taq酶（5Uμl-1）0.25μl，总体积25μl；扩增程序为：94℃2min，94℃1min，57℃1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min；D、决明ICS基因cDNA的5′末端巢扩反应使用5′RACE的基因特异引物ICS5-2与SMARTTMRACE试剂盒提供的3′末端巢扩引物ClontechNUP为引物对，以0.5μl一扩产物作为模板，进行决明ICS基因的5′末端巢扩反应；反应体系和PCR扩增程序同一扩。本专利技术的有益技术效果是：本专利技术方法首次获得决明SoICS基因的全序列，同时通过一种克隆决明SoICS基因的引物组和克隆方法，它能快速准确地克隆决明SoICS基因的全序列，为后续决明SoICS基因分子研究提供了理论基础。附图说明图1是本专利技术的SoICS3′-RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳；图2是本专利技术的SoICS5′-RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳；图3是本专利技术的扩增CoICS基因全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施实例一所用引物序列如下：ICS3-15′-GTTTGTGGG(T/C)TTCCA(A/G)CAGAAG-3′GeneRacer3′P5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′ICS3-25′-TATGC(T/G)GGGACAGGGATAGT-3′GeneRacer3′NP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ICS5-15′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA-3′ClontechUPM5′-GAGCAACTTGGTGAACTGAG-3′ICS5-25′-GAGTTCTAGCTCATCCCACTC-3′ClontechNUP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′FsoICS3S5′-ATGGCAACCGGAGCTGCACACA-3′RsoICS3S5′-ATTGATGGTGCTCAATGCTCATATACAGTC-3′。步骤一、决明总RNA提取和反转录分别取盛花期决明根、茎、叶、花蕾、花、荚果皮、幼嫩种子、幼果组织各0.1g于液氮中研磨，按照柱式小量植物组织抽提试剂盒说明，提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测质量合符要求后，分别进行反转录，获得cDNA第一链，冻存于-20℃备用；步骤二、3′-RACE和5′-RACE扩增用GeneRacer试剂盒和SMARTTMRACE试剂盒，分别进行3′-RACE和5′-RACE；A、决明ICS基因cDNA的3′末端一扩反应使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacerKit提供的GeneRacer3′P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进本文档来自技高网...

【技术保护点】
决明SoICS基因，其特征在于：该基因核苷酸序列为SEQID?NO：1。

【技术特征摘要】
1.决明SoICS基因，其特征在于：该基因核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述决明SoICS基因，其特征在于：所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQIDNO：2。3.根据权利要求1所述决明SoICS基因，其特征在于，所述决明SoICS基因的克隆引物组序列如下：ICS3-15′-GTTTGTGGGT/CTTCCAA/GCAGAAG-3′GeneRacer3′P5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′ICS3-25′-TATGCT/GGGGACAGGGATAGT-3′GeneRacer3′NP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ICS5-15′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA-3′ClontechUPM5′-GAGCAACTTGGTGAACTGAG-3′ICS5-25′-GAGTTCTAGCTCATCCCACTC-3′ClontechNUP5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′FsoICS3S5′-ATGGCAACCGGAGCTGCACACA-3′RsoICS3S5′-ATTGATGGTGCTCAATGCTCATATACAGTC-3′。4.一种如权利要求3所述决明SoICS基因的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法包括如下步骤：步骤一、决明总RNA提取和反转录；步骤二、3′-RACE和5′-RACE扩增；步骤三、决明ICS基因全长cDNA序列扩增；步骤四、PCR产物的克隆纯化与筛选。5.根据权利要求4所述的克隆方法，其特征在于：所述步骤二中3′-RACE和5′-RACE扩增包括如下步骤：A、决明ICS基因cDNA的3′末端一扩反应使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacerKit提供的GeneRacer3′P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进行3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李关荣，艾义，谭燕，米瑶，朱林蕙，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：