本发明专利技术提供具有任何纤维素分解活性例如纤维素酶活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明专利技术涉及具有任何纤维素分解活性例如纤维素酶活性例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶活性的多肽，编码这些酶的多核苷酸，以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。本发明专利技术提供具有寡聚体酶活性的多肽，例如，在生物质的糖化过程中将难分解可溶性寡聚体转化为可发酵的糖类的酶。本发明专利技术的多肽可用于多个药学、农业、食物和饲料加工以及工业领域。本发明专利技术还提供包含具有本发明专利技术的至少一种酶的酶混合物的组合物或制备产品。
【技术实现步骤摘要】
本申请是分案申请，原申请的申请日为2006年12月8日、申请号为200680054166.5 (PCT/US2006/046919)、专利技术名称为“”。政府支持本专利技术是依据能源部提供的第1435-04-03-CA-70224、1435-04-04-CA-70224 和DE-FC36-03G013146号DOE合同，在美国政府的支持下进行的。美国政府在本专利技术中享有一定的权利。光盘提交以下光盘提交的内容通过引用整体结合入本文:光盘上计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名:564462014241，记录日期:2006年12月6日，大小=1,843, 200字节);序列表的三份光盘拷贝之一(拷贝I)(文件名:564462014241，记录日期:2006年12月6日，大小:1，843，200字节);序列表的三份光盘拷贝之一(拷贝2)(文件名:564462014241，记录日期:2006年12月6日，大小:1，843，200字节);和序列表的三份光盘拷贝之一(拷贝3)(文件名:564462014241，记录日期:2006年12月6日，大小=1,843, 200字节)。专利
本专利技术涉及分子细胞生物学和生物化学。一方面，本专利技术提供具有纤维素分解活性例如纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、3 -葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶(mannanse)、木糖苷酶(例如，P _木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或寡聚体酶(oligomerase)活性的多肽、编码这些多肽的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。一方面，本专利技术提供具有寡聚体酶活性的多肽(例如，在生物质的糖化中将可溶性寡聚体转化为可发酵的单体糖的酶)、编码这些酶的多核苷酸以及这些多核苷酸和多肽的制备和使用。一方面，本专利技术提供本专利技术多肽的热稳定和耐热形式。本专利技术多肽可用于多个药学、农业和工业领域。专利技术背景纤维素是地球上最丰富的可更新资源。它由直链的P 1-4葡萄糖单元和纤维二糖(具有如图5所示的结构的葡萄糖二聚体)重复单元组成。此聚合体被包括内切葡聚糖酶(EG)(随机水解所述纤维素聚合体)和纤维二糖水解酶(CBH)(从纤维素移除末端的纤维二糖残基)的一组酶降解。纤维二糖和纤维寡糖被3 -葡糖苷酶(BG)水解为葡萄糖。所有这三种酶都是将纤维素完全分解为葡萄糖所必需的。对于这三种酶中的每一种，都存在执行相同功能的不同结构的变体。此外，除不同结构的变体外，已知真菌和细菌可生产多种形式的相同结构的变体。进一步使此系统变复杂的事实是，已知一些厌氧性细菌和真菌以多酶复合体形式产生这些酶，所述多酶复合体包含均连接至分子量超过200万道尔顿的酶支架的多个酶。为什么一个如此简单的分子必须使用一个如此复杂的酶系统？ 一些研究人员认为这种复杂性是由于底物的难分解性。纤维素链形成微原纤，该微原纤通过相邻链的氢键连接包装成晶态基质。此结构对化学或酶学降解具有高度的抗性。CBH由于其对纤维素的酶攻击性而被认为是降解此晶态纤维素的关键酶。与CBH不同，EG具有以垂直的角度攻击纤维素链的开放的裂缝。CBH通过包含活性位点的通道直接攻击纤维素链。目前的看法是纤维素链进入该通道，与此同时，相邻的氢键连接被断裂。一旦纤维二糖水解酶在底物上建立此“立足处”后，则EG即可进入，并且更容易攻击所述底物。已知的CBH的主要缺陷是它们的低催化活性。一些研究组认为此低活性是因为水解的能量被转化为断裂氢键和使酶沿所述底物前进的动能。CBH是外切作用(exo-acting)酶，并发现于90个糖基水解酶家族中的6个家族。它们包括家族5、6、7、9、10和48。家族5包含许多不同类型的糖基水解酶,包括纤维素酶、甘露聚糖酶(mannanase)和木聚糖酶。虽然此家族内的大多数纤维素酶为内切葡聚糖酶，但是也有纤维二糖水解酶的实例，最显著的是来自热纤梭菌(Clostridium thermocellum)的CelO。家族6仅包含内切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶，并且纤维二糖水解酶成员要多于内切葡聚糖酶。这些酶具有转化机制(inverting mechanism),并且晶体学研究暗示,该酶具有包含7个而不是8个平行P -链的扭曲的a/0桶结构。家族7的酶同样由内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶两种酶组成，具有更多的纤维二糖水解酶，并且仅有来自真菌的已知成员。该酶具有保留机制(retainingmechanism),并且晶体结构显示为P -果酱卷(0-jellyroll)结构。家族9包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和3 -葡糖苷酶，并以内切葡聚糖酶占优。但是，褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)产生内切/外切-1，4_葡聚糖酶,其晶体结构显示为(a/a)6桶折叠。该酶兼有内切和外切-葡聚糖酶CBH的性质。家族10仅包含2个纤维二糖水解酶成员，其余主要是木聚糖酶。家族10的纤维二糖水解酶和木聚糖酶具有对甲基-伞形酮(umbelIiferyl)纤维二糖苷的活性。家族48主要包含细菌和厌氧性真菌的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。其结构为类似于家族9的(^/^)6桶折叠。需要更加廉价和可再生的道路车辆燃料来源。新的燃料来源如果在燃烧后产生无害的终产物，则其将更具吸引力。乙醇是基于石油的燃料的有吸引力的替代品，其可通过发酵衍生自淀粉或木素纤维素的单体糖而获得。但是，由于乙醇的生产成本高，目前的经济条件并不支持其广泛使用。旨在降低成本的一个研究领域是增强可用于从生物质(例如，包含木素纤维素的组合物)产生可发酵的糖的酶的技术功效。更有效地消化生物质(例如，原料)的酶的开发将转化为乙醇生产成本的降低。更有效的过程将降低美国对外国石油的依赖和可能与此依赖有关的价格波动。使用更加清洁的运输燃料(像生物乙醇)可减少CO2净排放，而CO2净排放被认为是造成全球变暖的部分原因。由于生物质的复杂性，其转化为单体糖类涉及多种不同酶类的作用，如图6、7、8、62和63所示，这些图包括参与纤维素(图6、7和63)和半纤维素(图8和62)的消化的酶的示意图。生物质主要由糖类和非糖类物质组成。所述糖类可细分为纤维素((6-1, 4连接的葡萄糖部分的直链聚合体)和半纤维素(由3-1，4连接的木糖主链和阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸支链组成的复杂支链聚合体)。有时，木糖可被乙酰化，而阿拉伯糖可包含至其他半纤维素链或木质素的阿魏酸酯或肉桂酸酯。生物质的最后一种主要成分是木质素，一种高度交联的类苯基丙烷(phenylpropanoid)结构。纤维素酶将纤维素转化为葡萄糖，并且包括:(I)断裂内部的(6-1, 4糖苷键而生成链更短的葡糖寡糖(glucooligosaccharide)的内切葡聚糖酶，(2)作用于较小的寡糖末端而生成纤维二糖(双糖)的纤维二糖水解酶，和(3)将可溶性寡糖(DP2至DP7)转化为葡萄糖的(6-葡糖苷酶。已表明，单组分酶仅部分消化纤维素，完全转化为葡萄糖需要所有酶的协同作用。将半纤维素消化为糖单体需要更多的酶，包括木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。也可能涉及非糖基水解酶，如乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。专利技术概述本专利技术提供具有纤维素分解活性例如纤维素酶活性如内切葡聚糖酶、纤维二糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的、合成的或重组的核酸，其包括：(a)SEQ?ID?NO:519的核酸序列，其中所述核酸编码具有寡聚体酶活性的多肽；或(b)编码序列为SEQ?ID?NO:520的多肽的核酸序列。
【技术特征摘要】
2006.02.10 US 60/772,7861.一种分离的、合成的或重组的核酸，其包括: (a)SEQ ID NO: 519的核酸序列，其中所述核酸编码具有寡聚体酶活性的多肽；或 (b)编码序列为SEQID NO:520的多肽的核酸序列。2.如权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性寡聚体水解为可发酵的单体糖。3.如权利要求1所述的分离的、合成的或重组的核酸，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解为单体，并且所述单体包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。4.一种表达盒，其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。5.一种载体,其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。6.一种克隆载体,其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸。7.一种转化的细胞，其包含:包含权利要求1所述的序列的核酸、或权利要求4所述的表达盒、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的克隆载体。8.权利要求1所述的序列在制备转基因植物中的应用。9.权利要求1所述的序列在制备转基因种子中的应用。10.一种分离的、合成 的或重组的多肽(i)具有与SEQ ID N0:520 具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高或100%序列同一性的氨基酸序列； (ii)具有由权利要求1所述的核酸编码的氨基酸序列，其中所述多肽具有寡聚体酶活性。11.如权利要求10所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性寡聚体水解为可发酵的单体糖。12.如权利要求10所述的分离的、合成的或重组的多肽，其中所述寡聚体酶活性包括将可溶性纤维寡糖和阿拉伯木聚糖寡聚体水解为单体，并且所述单体包括木糖、阿拉伯糖和葡萄糖。13.一种制备转基因植物的方法，该方法包括如下步骤: (a)将异源核酸序列引入细胞，其中所述异源核酸序列包含权利要求1所述的序列，从而生成转化的植物细胞； (b)从所述转化的细胞生产转基因植物。14.一种在植物细胞中表达异源核酸序列的方法，该方法包括如下步骤: (a)使用可操作地连接至启动子的异源核酸序列转化所述植物细胞，其中所述异源核序列包含权利要求1所述的序列； (b)在其中所述异源核酸序列在所...
【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·A·格雷，莉姗·赵，米歇尔·卡约特，
申请(专利权)人：维莱尼姆公司，
类型：发明
国别省市：
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