本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及重组质粒、重组腺病毒质粒及重组腺病毒的应用。本发明专利技术提供了获得的含有双基因共表达同源重组质粒pAd.Easy-1(RGD)-pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN的大肠杆菌(其保藏编号为CCTCC?No.M2013212)和重组腺病毒Ad.(RGD)--ING4-PTEN能够用于制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物或应用于制备化疗增敏剂。
【技术实现步骤摘要】
含有重组腺病毒质粒的大肠杆菌及重组腺病毒的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及含有RGD修饰的双基因共表达重组腺病毒质粒的大肠杆菌及RGD修饰的双基因共表达重组腺病毒的应用。
技术介绍
肿瘤已取代心脑血管疾病成为全球头号杀手，据美国癌症协会(ACS)最新发表的全球癌症统计学数据报告显示，2008年全球癌症新发病例约为1270万，癌症死亡例数为760万；其中发展中国家的癌症新发病例和死亡病例分别占到56%和64%。在中国，恶性肿瘤发病率上升尤其迅猛，每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡人数为160万人。预计2020年发病和死亡人数将比2002年上升60%，目前对于肿瘤的常规治疗手段主要为手术、放疗、化疗等。手术是肿瘤最常用治疗手段，也是多数早期肿瘤的首选，虽然手术疗效显著，无生物抗性和敏感性，但风险高，成功率低，创伤大，易产生一系列并发症，常限用于早期肿瘤。放疗虽作用直接、迅速，对敏感度较高的早期癌种效果较好，可治疗手术困难的癌种，但对分化程度高的癌组织不敏感，且副作用大，对正常人体细胞和免疫系统会造成伤害。化疗主要与手术切除和放疗相配合，但其容易产生抗药性，且对肿瘤细胞并无特异性，易引起各种副作用，过度化疗甚至可能缩短患者的存活期，残存的肿瘤干细胞将成为肿瘤复发、转移的根源。综上所述各种肿瘤常规治疗手段均无法达到理想的治疗效果，迫使寻找新的治疗的方式。近年来，随着人们对肿瘤发生发展机制的深入以及肿瘤免疫学、分子生物学、生物工程技术的发展，肿瘤的生物治疗发展迅速，成为一种新的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗通常可概括为:任何生物学物质或生物制剂在肿瘤的治疗中的应用。已有的研究和临床应用已经展示出广阔的应用前景，有望成为常规的抗癌疗法。目前肿瘤的生物治疗研究得较多的技术主要包括细胞因子技术，过继免疫疗法，单克隆抗体及其偶联技术，肿瘤疫苗技术以及基因治疗。肿瘤是一种多基因疾病。是多种基因在时空上异常的结果。随着对肿瘤分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为肿瘤治疗的焦点之一。基因治疗技术可以概括为两大类:一类为替代或添加技术。即将治疗基因用各种方法送入肿瘤或正常细胞。可以是抑癌基因，也可以是各种细胞因子或免疫性基因。如将多种抑癌基因或凋亡诱导基因导入细胞可以抑制肿瘤生长及促进肿瘤细胞凋亡。另一类为基因封闭技术。如反义基因技术、核酶技术、RNA干扰技术等，利用以上技术封闭过度表达的癌基因及其产物、肿瘤耐药基因、细胞周期基因等可以封闭或降解基因或其产物以达到治疗目的。肿瘤基因治疗将成为继手术、化疗、放疗之后令人瞩目的临床肿瘤治疗的第四种模式，将给肿瘤患者带来新的希望。基因治疗本身的特性以及载体系统转导目的细胞的效率是基因治疗的两个最关键的要素。腺病毒载体作为基因治疗常用的载体系统具有以下优点:1.可以感染增殖和非增殖细胞，2.能够高效制备和 纯化高滴度重组病毒，3.它的基因组可以容纳大片段的外源基因，4.腺病毒载体与宿主细胞基因组不整合，属于条件复制缺陷性病毒，不产生具有感染性和致病性的子代病毒，安全性较高等。腺病毒用于肿瘤基因治疗，感染目的细胞的第一步是其与细胞表面的柯萨斯受体(CAR)相结合，很多肿瘤细胞及白血病淋巴细胞表面CAR的缺失导致腺病毒对其感染效率低下。如何提高感染效率是需要克服的困难之一。多基因联合治疗在肿瘤基因治疗领域具有重要的价值，通常采用两种办法来达到外源性基因的导入:一是使用多个独立载体分别向靶细胞转导目的基因，二是在一个载体上表达多个目的基因。目前基因治疗的瓶颈是转染和表达效率低下。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种含有R⑶修饰的pAd.Easy-1 (RGD) -pAdTrack-CMV-1NG4-p0 lyA-promoter-PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC Νο.Μ2013212。本专利技术采用双启动子(插入polyA+promoter)构建ING4或/和PTEN单、双基因共表达腺病毒载体，并使用RGD-4C修饰的骨架质粒进行同源重组，以提升腺病毒载体对靶细胞的转染效率和目的基因的表达效率。获得的重组腺病毒Ad.(RGD)-1NG4-PTEN能够用于制备治疗恶性肿瘤和/或白血病的药物或应用于制备放疗增敏剂。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案:由实验室专利技术提供了一种双基因共表达转移质粒pAdTrack-CMV-1NG4-polyA-promoter-PTENo精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)三肽序列(RGD)存在于多种细胞外基质中，可与11种整合素特异性结合，能有效地与细胞表面的整合素蛋白相粘附。Dmitriev等成功的将RGD-4C序列插入到腺病毒鞭毛区域的HI茎环上，使得腺病毒可以使用α V β 3整合素作为其粘附受体。这样的改造增加了腺病毒对柯萨斯受体(CAR)表达缺陷细胞的感染能力。PTEN基因是在1997年由3个不同的研究小组分别用不同的方法获得，分别命名为 PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten)、MMACl (mutated in multiple advanced cancers-1)和 TEP-1 (TGF-β-regulated andepithelial cell-enriched phosphatase),它是一种具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，不仅有脂质磷酸酶活性，而且有蛋白磷酸酶活性，定位于人类染色体10q23.3。PTEN蛋白主要呈网格状分布位于细胞胞浆中，近年发现其在核膜、核内都有表达。相比其他磷酸酶，PTEN活性中心有三个碱性氨基酸，如果产生突变失去了脂质磷酸酶活性,失去大多数肿瘤抑制功能，但不影响蛋白质磷酸酶活性。因此肿瘤抑制基因PTEN的抑癌效应主要取决于其脂质磷酸酶活性，但是蛋白质磷酸酶活性仍然可以影响细胞增殖、附着力和细胞迁移。生长抑制因子蛋白家族(inhibitorof growth family, ING)包括 ING1, ING2,ING3，ING4和ING5，是一组重要的肿瘤抑制因子。ING4于2002年从人的脑垂体中被分离出，2003年由Shiseki等鉴定，2004年正式被确定为一种重要的抑癌基因。该基因跨度为13kb，定位于人类染色体12pl3.31。研究表明，ING4基因可以通过控制p53乙酰化状态来调节P53的功能，使p53的转录活性增强，肿瘤的发生即被抑制。在体内ING4可抑制由原癌基因MYC或MYCN过度表达引起的细胞间接触抑制的丧失从而恢复细胞间的接触抑制。过表达ING4基因能够抑制肿瘤细胞的侵袭、转移，通过抑制NF-K B，/IL-6通路影响肿瘤新生血管的形成。低氧时HIF的上调是肿瘤生长过程中重要的促进因素，所以抑制HIF的活性可以抑制肿瘤的生长，提高肿瘤治疗的疗效。研究证实ING4能与缺氧诱导因子(HIF)脯氨酰羟化酶的铁依赖性氧化酶直接发生作用，通过ING4的募集反应来调节HIF的活性。ING4诱导的p21的上调可以增强细胞周期调节蛋白BI (cyclin BI)和p21的结合，启动细胞G2/M周期阻滞，最终抑制细胞的增殖，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有RGD修饰的pAd.Easy?1(RGD)?pAdTrack?CMV?ING4?polyA?promoter?PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC?No.M2013212。
【技术特征摘要】
1.一种含有 RGD 修饰的 pAd.Easy-1 (RGD) -pAdTrack-CMV-1NG4-polyA-promoter-PTEN双基因共表达同源重组腺病毒质粒的大肠杆菌，其保藏编号为CCTCC N0.M2013212。2.重组腺病毒Ad(RGD)-1NG4-PTEN的制备方法，其特征在于，由如权利要求1所述的pAd.Easy-1 (RGD) -pAdTrack-CMV-1NG4-polyA-promoter_PTEN 双基因共表达同源重组腺病毒质粒在包装细胞中包装产生。3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨吉成，缪竞诚，刘济生，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：
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