本发明专利技术涉及配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的技术,属于生物技术领域中的蛋白质复性技术。在一次修饰微球介质的基础上,对其配基进行再修饰以提高表面带环氧基团微球介质的电荷密度。利用具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质,进一步增强了微球介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用,从而更有效地抑制蛋白质聚集,大幅提高复性收率。相较于一次修饰微球介质辅助蛋白质复性,该法不仅具有介质用量少、蛋白质复性收率高的特点,而且对高盐等环境具有更好的耐受性。
【技术实现步骤摘要】
[0001 ] 本专利技术涉及配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的技术,属于生物
中的蛋白质复性技术。
技术介绍
基因工程技术的快速发展,为人类破译重大疾病、开发新型药物提供了重要技术支撑。目前,基因工程药物开发已逐渐进入成熟期,此类药物的生产必须借助适宜的重组基因表达系统。细菌表达系统因其具有表达量高、易于放大等优点,被广泛使用。但是利用该表达体系生产重组蛋白质时,往往由于目标蛋白质的表达量过高而在细胞内发生错误折叠及聚集,生成包涵体。包涵体不具有生物学活性,必须通过折叠复性以获得具有生物学活性的天然结构。在包涵体蛋白质的折叠复性过程中,变性蛋白质或折叠中间体间的疏水性相互作用极易引发蛋白质分子间聚集,因此抑制蛋白质聚集是促进复性的关键。在复性过程中,通过加入低浓度盐酸胍和尿素、精氨酸、表面活性剂等小分子添加剂可以提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度,从而抑制蛋白质聚集(Molecular levelinsight into intra-solvent interaction effects on protein stability andaggregation.Advanced Drug Delivery Reviews, 2011,63,1074-1085)。但是大多数添加剂在抑制蛋白质聚集同时也会抑制蛋白质分子的折叠,造成折叠速率的降低。近年来色谱复性技术受到研究者的广泛关注。色谱复性分为凝胶过滤色谱复性,吸附色谱复性以及固定化辅助因子色谱复性等。色谱复性集成了蛋白质复性和色谱分离纯化技术,同时实现了目标蛋白质的复性和分离纯化。但色谱介质与蛋白质分子间的吸附作用会导致蛋白质分子折叠速率的降低。此外,色谱复性后的产品浓度较低。为了克服小分子添加剂辅助复性和色谱复性技术的不足,近来有报道提出利用与复性蛋白质带有同种电荷`的微球介质,如琼脂糖凝胶介质、经高分子量(平均分子量为60000)的聚乙烯亚胺PEI (将其命名为PEIL)—次修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质PGMA-PEIL等抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(1n-exchangeresins greatly facilitate refolding of I ike-charged proteins at highconcentrations.Biotechnology and Bioengineering, 2011,108,1068-1077;1n-exchange resins facilitate like-charged protein refolding:Effects of porous solidphase properties.Journal of Chromatography A,2012,1225,168-173;Mono-sizedmicrospheres modified with poly(ethylenimine)facilitate the refolding oflike-charged lysozyme.Reactive and Functional Polymers,2012,72,889-896)。与传统的复性方法相比,同电荷微球介质促进蛋白质复性方法操作简单、介质回收方便且无需昂贵的大型设备。其中的琼脂糖凝胶介质比表面积较大,可被修饰为高电荷密度介质,但是其机械强度较差;相对于琼脂糖凝胶介质,无孔单分散PGMA-PEIL微球介质具有更好的机械强度,并可被修饰为超顺磁性微球从而大大简化分离操作,但是受到无孔微球介质较小的比表面积以及修饰方法本身的限制,PGMA-PEIL微球介质的电荷密度有限,限制了其辅助复性的效果。为了克服上述的缺陷,本专利技术提出了一种通过配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质电荷密度的方法,相较一次修饰微球介质,该介质促进了蛋白质复性效果。该法不仅具有介质用量少、蛋白质复性收率高的特点,而且对高盐等环境具有更好的耐受性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种配基再修饰提高表面带环氧基团微球介质的电荷密度促进同电荷蛋白质复性的方法。本专利技术在表面带环氧基团的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球介质PGMA表面修饰高分子量的聚乙烯亚胺制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL后,选用2- 二乙氨基氯乙基DEAE及平均分子量为1200的聚乙烯亚胺PEI (将其命名为PEISWf一次修饰微球介质的配基进行再修饰以进一步提高微球介质的电荷密度。利用具有更高电荷密度的配基再修饰微球介质,进一步增强了微球介质与同电荷蛋白质分子间的静电排斥作用,从而更有效地抑制蛋白聚集,大幅提高复性收率。本专利技术是通过下述技术方案加以实现的:配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法,其配基为DEAE或PEIS配基,步骤如下:I)合成无孔单分散微球介质PGMA,并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL,制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ;2)通过亲核反应配基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上,制备得到配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE 或 PGMA-PEIL-PEIS ;3)将上述步骤2)中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中,然后加入变性蛋白液复性;4)复性完成后,离心收集上清液,获得复性蛋白质溶液。所述的步骤3)复性缓冲液为:20~lOOmmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)U~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物;pH值为7.5~9.0。所述的步骤3)同电荷蛋白质为与配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。所述的步骤2)中,PGMA-PEIL-DEAE的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中,加入5~25mL浓度为0.1~1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烧盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5mol/L的NaOH溶液,使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L ;上述体系置于50~60°C、50~170rpm条件下反应I~2h ;冷却后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~8000rpm的条件下反复离心水洗,直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净。所述的步骤2)中,PGMA-PEIL-PEIS的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中,加入10~50mL戍二醒体积分数为10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液,使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L,于25~30°C、50~170rpm的条件下反应4~6h ;反应结束后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~SOOOrpm条件下反复离心水洗,直至将游离的戊二醛清洗干净;随后,将微球介质移入10~50mL含有50~200g/L PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸钠缓冲液中,使微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L,于25~30°C、50~170rpm条件下反应48~60h ;反应结束后,将微球介质用去离子水,在转速为本文档来自技高网...
【技术保护点】
配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法,其特征在于配基为DEAE或PEIS配基,步骤如下:1)合成无孔单分散微球介质PGMA,并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL,制备得到一次修饰微球介质PGMA?PEIL;2)通过亲核反应配基修饰于PGMA?PEIL微球介质表面的PEIL配基上,制备得到配基再修饰微球介质PGMA?PEIL?DEAE或PGMA?PEIL?PEIS;3)将上述步骤2)中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中,然后加入变性蛋白液复性;4)复性完成后,离心收集上清液,获得复性蛋白质溶液。
【技术特征摘要】
1.配基再修饰提高微球介质电荷密度促进蛋白质复性的方法,其特征在于配基为DEAE或PEIS配基,步骤如下: I)合成无孔单分散微球介质PGMA,并在PGMA微球介质表面修饰平均分子量为60000的聚乙烯亚胺PEIL,制备得到一次修饰微球介质PGMA-PEIL ; 2 )通过亲核反应配基修饰于PGMA-PEIL微球介质表面的PEIL配基上,制备得到配基再修饰微球介质 PGMA-PEIL-DEAE 或 PGMA-PEIL-PEIS ; 3)将上述步骤2)中的配基再修饰微球介质加入同电荷蛋白质的复性缓冲液中,然后加入变性蛋白液复性; 4)复性完成后,离心收集上清液,获得复性蛋白质溶液。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤3)复性缓冲液为:20~IOOmmol/L三轻甲基氨基甲烧、1~3mmol/L乙二胺四乙酸二钠、0~0.lmol/L NaCl及0~2mol/L尿素的混合物;pH值为7.5~9.0。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤3)同电荷蛋白质为与配基再修饰微球介质带有相同电荷的蛋白质。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤2)中,PGMA-PEIL-DEAE的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中,加入5~25mL浓度为0.1~1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烷盐酸盐溶液以及等体积的浓度为3.5moI/L的NaOH溶液,使PGMA-PEIL微球介质在反应体系中的浓度为50~100g/L ;上述体系置于50~60°C、50~170rpm条件下反应I~2h ;冷却后,将微球介质用去离子水,在转速为5000~8000rpm的条件下反复离心水洗,直至将游离的DEAE和NaOH清洗干净。5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述的步骤2)中,PGMA-PEIL-PEIS的制备方法是:称取1.0~5.0g PGMA-PEIL微球介质于锥形瓶中,加入10~50mL戊二醛体积分...
【专利技术属性】
技术研发人员:孙彦,杨春燕,史清洪,董晓燕,
申请(专利权)人:天津大学,
类型:发明
国别省市:
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