一种双链聚肌胞干粉的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种双链聚肌胞干粉的制备方法，所述方法包括：（1）将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用磷酸盐缓冲液溶解，混合后加入稳定剂，混合均匀，在40~100℃下保温；（2）步骤（1）反应液自然冷却后与有机溶剂混合，静置沉淀，沉淀物干燥，即得所述双链聚肌胞干粉；本发明专利技术的有益效果主要体现在：本发明专利技术提供了一种双链聚肌胞干粉的制备方法，制成的聚肌胞干粉具有完整的双螺旋结构特征和生理活性，质量和稳定性要比溶液状态下的聚肌胞要好很多，进入生物体内较裸露的聚肌胞有更强的抗酶解性能，从而增强了疗效。而且在双链聚肌胞溶液制成干粉的过程中对其进行了纯化，去除了很多小分子物质和杂质，降低了毒副作用，提高了双链聚肌胞的质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
双链聚肌胞是一种人工合成的双链核糖核酸，可诱导产生干扰素，具有广谱抗病毒作用；此外还有调节机体免疫功能，增强人体非特异性免疫功能和某些特异性免疫功能，达到抗肝细胞坏死和抗肿瘤作用等。双链聚肌胞在化妆品中应用可以消除痘痘、扁平疣等皮肤赘生物。双链聚肌胞在兽药方面主要应用于预防和治疗家禽、家畜病毒性疾病，使用方便、广泛，可以与许多药物同时使用，具有协同或相加作用。本品无种属特异性，可广泛在家禽、猪、牛等动物上使用，同时它还具有抗病毒谱广，毒性小、安全范围大的优点。双链聚肌胞是一种动物免疫增强剂，可作为疾病治疗辅助用药，增强动物肌体免疫力、提高药物的疗效。同时，双链聚肌胞也是一种免疫佐剂，在用疫苗免疫的同时使用，可明显提高免疫效果，并且有预防免疫应激及其它病毒性疾病的发生。 一方面，目前粉末状聚肌胞是制剂形式(是预混剂，不是原料形式)，一般多采用聚肌苷酸溶液和聚胞苷酸溶液经聚合后，直接添加辅料制得，该干粉中聚肌胞的含量偏低。另一方面，现已报道的文献中，聚肌胞制剂的制备一般是以聚肌苷酸、聚胞苷酸为原料经过一步反应后得到中间体聚肌胞溶液，再进行制剂工序的操作。其不足之处在于，首先制剂生产线中增加聚合反应步骤，不仅增加操作的复杂性，还增加了监控的难度。其次，聚肌胞中间体是以溶液形式存在，贮藏条件及期限更加严格。因此，本领域迫切需要提供一种含量高、稳定性高且制备简单的双链聚肌胞干粉的制备方法。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种含量高、稳定性高且制备简单的双链聚肌胞干粉的制备方法。本专利技术采用的技术方案是: ，所述方法包括: (1)将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用适量pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液溶解，混合后加入稳定剂，混合均匀，在40-100?下保温0.5飞小时；所述稳定剂为下列之一或其中两种以上的混合物:卡那霉素、壳寡糖、氯化钙、多聚赖氨酸(包括各种规格的ε -多聚赖氨酸、L-多聚赖氨酸等)、葡萄糖酸钙；所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1: 0.5~1.5，稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2^2.0倍；所述磷酸盐缓冲液用量以将聚肌苷酸和聚胞苷酸充分溶解为宜，推荐用量为将聚肌苷酸和聚胞苷酸配制成1(T100 g/L的溶液； (2)步骤(1)反应液自然冷却后与0.5^20倍体积的有机溶剂混合，静置沉淀0.5^72小时，取沉淀物2(T60°C低温干燥，即得所述双链聚肌胞干粉；所述有机溶剂为下列之一或其中两种以上的混合物：乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、异丙醇、正丙醇。本专利技术中的双链聚肌胞干粉为原料形式，采用碱基互补配对原则将多聚肌苷酸、 多聚胞苷酸，并加入稳定剂聚合后，再用有机溶剂沉淀得到高质量的双链聚肌胞干粉。该干 粉中双链聚肌胞含量高，可直接用于各种剂型制剂的制备，可以使制剂的制备过程更加简 单，易于操作，目前市场需求量很大。另外，加入稳定剂不仅可以增大分子量，还可以使双链 聚肌胞的稳定性（由于PIC为大分子聚阴离子，加入稳定剂后可以使PIC双链结构的稳定性 增加)增强，优于溶液形式，易于保存。另外经过有机溶剂沉淀处理后样品的增色效应(通过 碱处理使双链聚肌胞的双螺旋结构破坏，碱基充分外露，导致紫外吸收增加的现象称为 增色效应，该指标直接影响产品的功效）指标更优。优选的，步骤（1)所述稳定剂为壳聚糖，多聚赖氨酸(包括各种规格的e -多聚赖 氨酸、L-多聚赖氨酸等）或卡那霉素。优选的，步骤（2 )所述有机溶剂为乙醇或甲醇。优选的，步骤（1)中,所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1 : 0.8?1.2,稳 定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0. 2^1. 5倍。所述双链聚肌胞干粉可进一步制成双链聚肌胞水溶液，因此所述方法在步骤（2) 之后还可包括步骤（A):配制pH6. (T8. 0的磷酸盐缓冲液，加入适量的双链聚肌胞干粉和 NaCl，定容至双链聚肌胞干粉终浓度为0. Ori. 0 g/L，NaCl终浓度为4. 5g^9. Og/L,即得所 述双链聚肌胞水溶液。按此方法制得的双链聚肌胞水溶液，疗效高，安全可靠，无毒、无害、 无残留，工艺简单，实用性强，可用于预防和治疗人和动物病毒性疾病，也可用作免疫佐剂。或者所述双链聚肌胞干粉进一步制成双链聚肌胞预混剂，因此所述方法在步骤 (2)之后还可包括步骤（B):按照预混剂中双链聚肌胞干粉的质量百分含量为0. 5?40%、 Na2HP04 ? 12H20质量百分含量为0. 05?10%、NaH2P04 ? 2H20质量百分含量为0. 05?10%、余量 为辅料的配比，定量称取双链聚肌胞干粉，以及Na2HP04 ? 12H20和NaH2P04 ? 2H20,并添加适 量辅料，充分粉碎，过60目筛后，混合均匀，再过100目筛，分装后密封保存，即得所述双链 聚肌胞预混剂；所述辅料为下列之一或其中两种以上的混合物：葡萄糖、乳糖、药用淀粉、 可溶性糊精、复合核苷酸、氯化钠。具体的，所述辅料可为复合核苷酸、氯化钠，以及葡萄糖或药用淀粉的混合物，添 加比例以占预混剂的质量百分比计，复合核苷酸为0. 5^10 %，氯化钠为f 10%，余量为葡萄 糖或药用淀粉。即预混剂质量百分比组成如下：双链聚肌胞干粉0. 59T40%、Na2HP04 ? 12H20 0. 05%?10%、NaH2P04 *2H20 0. 05%?10%，复合核苷酸(TlO %，氯化钠0?10%，余量为葡萄糖或 药用淀粉。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了， 制成的聚肌胞干粉具有完整的双螺旋结构特征和生理活性，并且该双链聚肌胞干粉的质量 和稳定性要比溶液状态下的聚肌胞要好很多，进入生物体内较裸露的聚肌胞有更强的抗酶 性能，从而增强了疗效。而且在双链聚肌胞溶液制成干粉的过程中对其进行了纯化，去除了 很多小分子物质和杂质，降低了毒副作用，提高了双链聚肌胞的质量。(一）【附图说明】图1为产物紫外鉴定结果。(二）【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此: 下述实施例涉及的含量测定方法为: 精密称取双链聚肌胞复合物适量，配制成每Iml含IOmg的水溶液，照磷测定法测定聚肌胞含磷量。每Img的磷相当于10.25mg的聚肌胞。按(C19H23N7O14P2)n干燥品计算其含量。下述实施例涉及的增色效应测定方法为: 取双链聚肌胞复合物适量，用氯化钠一磷酸盐缓冲液(PH7.2)制成每Iml中约含0.08mg的溶液，照分光光度法，在248nm的波长处测定吸收度A1 ;然后精确量取该溶液IOml置一试管中，加6mol/L氢氧化钠溶液20μ1，摇匀，立即在同一波长处测定吸收度A2，按下式计算即得:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双链聚肌胞干粉的制备方法，所述方法包括：（1）将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用适量pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲液溶解，混合后加入稳定剂，混合均匀，在40~100℃下保温0.5~5小时；所述稳定剂为下列之一或其中两种以上的混合物：卡那霉素、壳寡糖、氯化钙、多聚赖氨酸、葡萄糖酸钙；所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1∶0.5～1.5，稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2~2.0倍；（2）步骤（1）反应液自然冷却后与0.5~20倍体积的有机溶剂混合，静置沉淀0.5~72小时，取沉淀物20~60℃干燥，即得所述双链聚肌胞干粉；所述有机溶剂为下列之一或其中两种以上的混合物：乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、异丙醇、正丙醇。

【技术特征摘要】
1.一种双链聚肌胞干粉的制备方法，所述方法包括: (1)将聚肌苷酸和聚胞苷酸各自用适量ρΗ6.0-8.0的磷酸盐缓冲液溶解，混合后加入稳定剂，混合均匀，在40-100?下保温0.5-5小时；所述稳定剂为下列之一或其中两种以上的混合物:卡那霉素、壳寡糖、氯化钙、多聚赖氨酸、葡萄糖酸钙；所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1: 0.5~1.5，稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2~2.0倍; (2)步骤(1)反应液自然冷却后与0.5^20倍体积的有机溶剂混合，静置沉淀0.5^72小时，取沉淀物2(T60°C干燥，即得所述双链聚肌胞干粉；所述有机溶剂为下列之一或其中两种以上的混合物:乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、异丙醇、正丙醇。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)所述稳定剂为壳聚糖、多聚赖氨酸或卡那霉素。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述有机溶剂为乙醇或甲醇。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述聚肌苷酸、聚胞苷酸质量用量之比为1: 0.8~1.2，稳定剂质量为聚肌苷酸和聚胞苷酸质量之和的0.2^1.5倍。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述双链聚肌胞干粉进...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅得响，卢凰姗，王宏，费丽燕，郭苏，
申请(专利权)人：杭州美亚药业有限公司，
类型：发明
国别省市：