Gibson组装载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及DNA合成领域，更具体而言涉及DNA大片段拼接，特别是用于DNA片段组装的载体。本发明专利技术提供了Gibson组装载体及其制备方法和应用。

【技术实现步骤摘要】
G i bson组装载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及DNA合成领域，更具体而言涉及DNA大片段拼接，特别是用于DNA片段组装的载体。
技术介绍
随着DNA合成技术的发展，现阶段已达到能够简便、快速、高效合成DNA片段的程度，成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。碍于寡核苷酸合成长度、精度和成本的限制，在进行基因合成甚至全基因组合成的时候需要对短片段寡核苷酸或者双链DNA进行逐级组装，因而开发高通量、低错误率、快速的DNA片段组装方法成为了合成生物学需要解决的另一个重要难题。在众多已开发的组装方法中，Daniel D Gibson等人开发了一种用于DNA大片段拼接的技术，称为Gibson组装策略，在合成生物学领域具有广泛的应用前景。该技术的主要思路是:对两段具有末端同源序列的DNA片段，通过核酸外切酶降解，切出粘性末端，两段DNA片段同源的粘性末端互补配对，再通过DNA聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的 DNA 片段拼接起来(Daniel G Gibson, Lei Young, Ray-Yuan Chuang, JCraig Venter, Clyde A Hutchison III, Hamilton 0 Smith.Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nature Methods, 2009，6(5):343-345)。但是在将拼接好的DNA片段克隆到载体的过程中，每次都要重新设计DNA片段与载体之间的同源区，由于DNA片段以及载体的差异，同源区的性质差别很大，使得克隆过程变的繁琐并具有很大的不稳定性。因此，有必要构建 一个具有通用性的Gibson组装载体。
技术实现思路
在第一方面,本专利技术提供了一种Gibson组装载体,所述载体的序列为SEQ ID N0.3或 SEQ ID N0.4。本专利技术的Gibson组装载体分别被命名为pSBGAA (SEQ ID(SEQID N0.4)，它们的图谱分别为图1和图2。在第二方面，本专利技术提供了一种构建Gibson组装载体的方法，所述方法包括步骤:I)分别以质粒pSBlA3和pSBlK3为模版，用引物pSB_F和pSB_R进行PCR扩增，得到两端分别带有Gibson组装同源序列和BamHI酶切位点的线型载体，所述引物的序列分别是 SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 ；2)经过BamHI酶切、连接反应，得到环状目标载体。在一个实施方案中，所述载体的序列为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4。在第三方面，本专利技术提供了 Gibson组装载体用于组装DNA长片段的用途。在一个实施方案中，所述Gibson组装载体的序列为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4。在第四方面中，用于Gibson组装载体的重叠区L和重叠区R，所述重叠区L和重叠区R分别是的随机DNA序列，例如20bp-100bp,优选30bp_50bp，特别是40bp，中间以BamHI酶切位点相连。在一个实施方案中，随机序列设计要求为:长度各为30bp_50bp(例如40bp)，CG含量适中(40%-60%)，无重复序列(连续5个或以上相同碱基，如AAAAA ;连续四个或以上两碱基重复，如ATATATAT)，单链DNA无明显二级结构(AG自由能<3kCal/mol)，退火温度适中(60°C -70°C)，与宿主细胞(大肠杆菌)基因组无近源序列，不易生成二聚体等。在一个具体实施方案中，所述重叠区L的序列是SEQ ID N0.1，重叠区R的序列是SEQ ID N0.2。在一个实施方案中，本专利技术还涉及两端含有上述重叠区L和重叠区R的Gibson组装载体。在第五方面中，本专利技术涉及引物对pSB-F和pSB-R，其中pSB-F的序列是SEQ IDN0.5，pSB-R 的序列是 SEQ ID N0.6。在Gibson组装实验中，将拼接好的DNA片段克隆到载体的过程中，每次都要重新设计DNA片段与载体之间的同源区，由于DNA片段以及载体的差异，同源区的差别，使得克隆过程变的繁琐并具有很大的不稳定性。因此，利用本专利技术中构建的通用载体，可以使Gibson组装的DNA片段设计更简单，组装结果更高效、更稳定。【附图说明】图1.质粒pSBGAA图谱。图2.质粒pSBGAK图谱。图3.酶切鉴定电泳图。M为表示DNA片段大小的标准物，名字就是λ-HindIIIdigest DNA Marker (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D3403A); I为克隆I的双酶切鉴定结果；2为克隆2的双酶切鉴定结果。图4.酶切鉴定电泳图。M为表示DNA片段大小的标准物，名字就是λ-HindIIIdigest DNA Marker (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D3403A); I为克隆I的双酶切鉴定结果；2为克隆2的双酶切鉴定结果。序列表说明SEQ ID N0.1-重叠区 LGGATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTGCCACCSEQ ID N0.2_ 重叠区 RGGATCCTGTGCATCACTTCTCACGTCTGAACCAAGATAGCTGTACSEQ ID N0.3-pSBGAA 序列GATCCAGCACTACATCAACTGACTACTGACTACTGACTGCCACCGATTACTTCGCGTTATGCAGGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCACAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTXVXSVX0X303V3X30VXV3X3XXX3SSX03C)VVSC)3XX333X3XXX33S3XC)X33VXVS33VXX3S3C)X000§0^^0^00^0^0000^00^000^00?00^00000^^^0000<00<^<0?<^<^0<00<0§00?§03XSV3V3X0VV3X33V3XVVVVV3V3XV30V3V0X33333333X3SV3V33XXXXX3SX3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Gibson组装载体，所述载体的序列为SEQ?ID?No.3或SEQ?ID?No.4。

【技术特征摘要】
2012.08.15 CN 201210290214.81.一种Gibson组装载体，所述载体的序列为SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4。2.权利要求1的Gibson组装载体，它们的图谱分别为图1和图2。3.一种构建Gibson组装载体的方法,所述方法包括步骤: 分别以载体PSB1A3和pSBlK3为模版，用一对引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6进行PCR扩增，得到两端分别带有Gibson组装同源序列和BamHI酶切位点的线型载体， 经过BamHI酶切、连接反应，得到环状目标载体。4.权利要求3的方法，所述Gibson组装载体的序列为SEQID N0.3或SEQ ID N0.4。5.Gibson组装载体用于组装DNA片段的用途。6.权利要求5的用途，所述Gibson组装载体的序列为SEQID N0.3或SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泰，康康，沈玥，王俊，汪建，杨焕明，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：