本发明专利技术涉及蛋白表达领域，特别涉及精氨酸在提高发酵培养含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。该方法通过向发酵培养基或培养液中添加精氨酸，为细胞表达蛋白提供前体物质，从而使重组蛋白产量得到提高。本发明专利技术提出在发酵培养基或培养液中加入定量的精氨酸，从而显著提高重组细胞表达外源蛋白的产量，可提高36%及以上。
【技术实现步骤摘要】
本申请要求于2012年08月17日提交中国专利局、申请号为201210295925.4、专利技术名称为“”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本专利技术涉及蛋白表达领域，特别涉及精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。
技术介绍
精氨酸，学名为2-氨基-5-胍基-戊酸，是一种脂肪族的碱性的含有胍基的极性α氨基酸，在生理条件下带正电荷。L-精氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物必需氨基酸和生糖氨基酸，D-精氨酸在自然界中尚未发现。精氨酸中，与主链最接近的旁链部份是较长、有机及疏水的，而另一端的旁链则是一个胍基，这个胍基的酸度系数(PKa值)为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电荷的。因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电极离开原位，这个胍基能形成多重的氢键。精氨酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力，使得它能与带有负电荷的分子结合。因此，精氨酸在蛋白质的外围，能在带电荷的环境下产生相互作用。精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。作为一氧化氮的前体，精氨酸可以协助舒张血管。非对称性二甲基精氨酸(ADMA)会压抑一氧化氮的化学作用，所以ADMA被认为是血管疾病的标记，就像精氨酸是健康内皮细胞层的象征一样。细胞培植研究指出当有机体外(试管内)赖氨酸与精氨酸的比例偏向赖氨酸时，可以压抑病毒的复制。在治疗上的成效却是未知的，但食用精氨酸会影响注射赖氨酸的效用。病人在进行手术(如胆囊切除术)以前，如先补充30g的精氨酸，会使病人维持正氮平衡而易于恢复.对肿瘤病人在进行大手术前鼻饲匀膳时，补充25g的精氨酸比补充同样氮含量的甘氨酸有效得多，更易于保持氮的正平衡.要使精氨酸发挥上述功效，其剂量较大甚至要达到每千克体重0.5g。氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽，例如甘精胰岛素前体和猪蛔虫抗菌肽cecropin P1，序列中含有连续的两个精氨酸。甘精胰岛素，化学名称为21A —Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰岛素，分子式为 C267H4tl4N72O78S6,分子量为 6063。甘精胰岛素是一种在中性PH液中溶解度低的人胰岛素类似物。在胰岛素与其受体结合的动力学方面，甘精胰岛素同人胰岛素极为相似。因此可以认为它与经由胰岛素受体而介导胰岛素的作用相同，其主要作用是调节糖代谢。通过促进骨骼肌和脂肪等周围末梢组织摄取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的产生而降低血糖的。临床药理学的研究表明，静脉注射等剂量的甘精胰岛素和人胰岛素，其效价是相同的。像所有的胰岛素一样，甘精胰岛素的作用时程可能受体力活动及其他因素的影响。对健康人及I型糖尿病患者的正常血糖钳夹研究表明，皮下注射甘精胰岛素的起效时间比低精蛋白锌人胰岛素(NPH)胰岛素慢，但甘精胰岛素的作用特性为平稳、无峰值、作用时间长。甘精胰岛素前体经过酶切纯化后即可获得甘精胰岛素。而甘精胰岛素前体的表达，与胰岛素的表达方法相似，可以参照专利US5656722、US4916212、CN1614019和CN1854299等。实验发现，甘精胰岛素前体与胰岛素前体相比，表达量较低。猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl是一种具有广谱抗菌作用的抗菌肽,能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长。重组猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl有希望在饲料中的获得应用。通常，通用的发酵培养基或培养液中均含有细胞生长以及表达外源蛋白所需的碳源、氮源、无机盐以及微量元素等成分，但并不一定含有小分子氨基酸。但细胞在大量表达外源蛋白时，如猪蛔虫抗菌肽cecropin P1、甘精胰岛素前体,其对某种特定氨基酸的需求大幅增加，若不能通过现有营养满足，那么这种氨基酸将可能成为限制蛋白产量的重要因素。例如当生物合成多肽中出现两个连续的精氨酸时，可能受到供应的限制，从而在一定程度上制约了多肽生物合成的速度，此多肽的常规表达量较低。因此，在培养基或培养液中直接加入精氨酸，作为重组多肽合成的前体物质，有利于提高多肽的合成速率，促进表达水平的提闻。目前，重组大肠杆菌中新型溶栓酶(NTA)的发酵与表达优化在采用大肠杆菌表达NTA时，通过添加锌离子和乳糖提高外源蛋白的表达水平；申请号为200710027210.X、专利技术名称为“分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法”的中国专利公开了在发酵过程中流加补料甲醇能够提高蛋白酶的表达；申请号为201110239375.X、专利技术名称为“一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法”的中国专利公开了在发酵过程中补加蔗糖；申请号为201010166684.4、专利技术名称为“一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法”的中国专利公开了在发酵过程中补加加盐培养基。上述技术均在发酵过程中补充碳源、氮源、无机盐、诱导物来提高蛋白的表达。但是，如何提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法却未见报导。`因此，提供一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸这种特定序列结构的多肽的表达量的方法具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。该方法通过向发酵培养基或培养液中添加精氨酸，为细胞表达蛋白提供前体物质，从而使重组蛋白产量得到提高。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案:本专利技术提供了精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用。多肽，通常由10~100氨基酸通过肽键连接起来形成的化合物称为多肽。它们的分子量低于lOOOODa。氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽是指在氨基酸序列中含有连续两个或更多精氨酸的多肽，例如本专利技术中举例的甘精胰岛素前体、猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl等，其氨基酸序列中含有连续精氨酸-精氨酸的结构。通用的发酵培养基或培养液中均含有细胞生长以及表达外源蛋白所需的碳源、氮源、无机盐以及微量元素等成分，但并不含有小分子氨基酸。细胞在大量表达外源蛋白时，如猪蛔虫抗菌肽cecropin P1、甘精胰岛素前体,其对某种特定氨基酸的需求大幅增加,若不能通过现有营养满足，那么这种氨基酸将可能成为限制蛋白产量的重要因素。精氨酸侧链含有3个C，以及一个碱性基团胍基，由于结构相对复杂，生物体合成精氨酸的代谢过程涉及多个步骤，因而其在蛋白质合成过程中很可能成为限制因素。其由α -酮戊二酸在乙酰谷氨酸合成酶作用下合成N-乙酰谷氨酸，与ATP在乙酰谷氨酸激酶作用下形成N-乙酰-Y谷氨酰磷酸，其与NAD (P)H在乙酰谷氨酸脱氢酶作用下形成N-乙酰谷氨酸--半醛，然后在转氨酶作用下合成N-乙酰鸟氨酸，再由乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶作用合成L-鸟氨酸，然后跟氨基甲酰磷酸一起在鸟氨酸氨甲酰转移酶作用下合成瓜氨酸；再在精氨基琥珀合成酶作用下合成精氨酰琥珀酸；最后在精氨基琥珀酸裂解酶作用下形成精氨酸。该过程须由多个基因共同调节。当生物合成多肽中出现两个连续的精氨酸时，可能受到供应的限制，从而在一定程度上制约了多肽生物合成的速度，此多肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸?精氨酸的多肽的表达量中的应用。
【技术特征摘要】
2012.08.17 CN 201210295925.41.精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为原核表达系统和真核表达系统。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为酵母表达系统。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酵母表达系统中宿主细胞选自毕赤酵母属。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述毕赤酵母的菌株为GS115或X33。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽为甘精胰岛素前体或猪蛔虫抗菌月太 cecropin Pl08.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽为甘精胰岛素前体。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘精胰岛素前体的C肽序列为SEQIDNO:1所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列、SEQID NO:4所示氨基酸序列或SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘精胰岛素前体无C肽。11.一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤:· 取基因工程构建菌株经第一接种到种子培养基中，经第一培养获得种子液； 取所述种子液经第二接种到发酵培养基中...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小锋，李利佳，李晓平，郑翔芳，张均，李文佳，
申请(专利权)人：宜昌长江药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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