一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。采用本发明专利技术提供的基因获得的重组酶具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性以及耐酸性环境等优点，对提高啤酒，葡萄酒，果汁饮品等非生物稳定性具有明显效果，具有重大应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其应用
本专利技术涉及一种脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，更尤其是来源于A.0ryZae和A.flavus的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因及其表达与应用，属于生物工程
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技术介绍
蛋白酶是具有催化蛋白水解生成胨、腙、多肽、氨基酸的一大类酶。蛋白酶按作用方式可分为内外肽酶；按活性中心分为丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，金属蛋白酶和羧基蛋白酶；按照蛋白酶来源分为植物，动物，微生物蛋白酶。其中丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用。丝氨酸蛋白酶家族成员非常庞大，分为81类，如胰脏分泌的消化胰酶蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、血液凝固中的凝血酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶以及氨肽酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。丝氨酸蛋白酶活性部位都含有Ser、His、Asp,并具有相同的催化机制,但是他们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性，正由于这种结构上微小变化，从而引起其在功能上的差异。并且，由于丝氨酸蛋白酶在结构上全为P蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域(N结构域和C结构域)，这两个结构域在结构上的差异导致它们在功能和进化上的作用差异。脯氨酸特异性内切蛋白酶，也称脯氨酰内肽酶(proline specificendoprotease, prolyl endopeptidase,简称PEP) [EC.3.4.21.26]或脑氨酸寡妝酶，属于丝氨酸蛋白酶中一种新的家族，该家族能专一性地水解多肽中脯氨酸残基的羧基端肽键，含有典型的丝氨酸蛋白酶家族的G-X-S-X-G/A高度保守序列，但是活性位点Ser周围的氨基酸残基和其他典型的丝氨酸蛋白不同，而且与已知的丝氨酸蛋白酶家族(包括胰蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶Y)相比，在一级结构上同源性很低。 脯氨酸(Pro)是唯一具有亚氨结构的氨基酸，其环状结构影响了与其它氨基酸形成肽键时的空间构象。脯氨酸特异性内切蛋白酶对Pro在多肽中的位置和成键的构型都有很强的专一性，且能够特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键。因此，可以应用于食品工业、医药、多肽工业等领域；同时可以作为一种分子生物学的工具酶，应用于蛋白质序列测定，肽谱分析、特异位点的酶切、肽链的修饰以及加工等。特别地，在食品工业方面，由于蛋白质水解产物可以为特定人群提供营养补充，因此有广泛的市场效应。来自乳清产品特别受欢迎的原因在于其极好的口感及良好的可溶性。但是，目前这些酪蛋白水解产物还未获得广泛的流行，缺乏市场渗透力的主要原因在于酪蛋白水解过程中所产生的苦味，这种出现苦味的情况代表了一个技术问题，目前在食品工业上还没有解决。但是可以确定的是苦味通常是很多蛋白质的水解产物，研究表明，苦味和几个特别的苦味肽相关，而不是大量的普遍的苦味肽。Matoba发现水解氨基酸C末端或N末端位置的肽类可以出现较少的苦味，而水解氨基酸涉及肽键两端的肽类的苦味则更多。酪蛋白富含疏水性氨基酸尤其是脯氨酸，Caprralla发现水解产物显著脱苦味伴随着疏水肽类出现的选择性降解。众所周知，包含脯氨酸残基的肽键很难被已知可购买的工业用酶切开。脯氨酸残基在肽的羧基末端的高发生率与低的苦味相关，并且证明了羧基末端脯氨酸残基预期的高发生率只能用高浓度的脯氨酸特异性内切蛋白酶来实现。因此，在食品工业中，脯氨酸特异性内切蛋白酶不仅在解除直接与抑制苦味相关的苦味肽获得优质的蛋白质水解产物应用显示出了无以伦比的优越性，还在不直接与抑制苦味相关，比如将减少食物蛋白质的变应原性；减缓所得生面团制作面包的腐败；生成富含脯氨酸的肽作为各种食物或营养产品的理想添加剂，以增强蛋白质利用。尤其引人注目的是，该酶还可以用于啤酒酿造，解决啤酒实际生产过程中的冷混浊问题。主要是因为大麦蛋白质中富含脯氨酸序列很丰富，且在他们非发芽的形式时谷类蛋白质是极其难以降解成生产适当的可发酵的麦芽汁所必需的游离氨基酸。目前已经发现的脯氨酸特异性内切蛋白酶主要有:一是来自于动物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。二是来自于植物的脯氨酸特异性内切蛋白酶类。它们主要存在于菠菜，蘑菇菌类等，主要是双孢子蘑菇。三是来自于微生物的脯氨酸特异性内切蛋白酶。目前已在细菌如脑膜败血性黄杆菌属，黄单胞菌属，嗜水气单胞菌，产气单胞菌属，假单胞菌属，假平胞菌荚膜，盐生盐杆菌和曲霉中发现该酶的存在，并且克隆得到编码脑膜败血性黄杆菌属(Genbank:M81461.1),嗜水气单胞菌(Genbank:D14005.1),产气单胞菌(Genbank:AF065429)，假平胞菌荚膜(Genbank:ABO10298)，黄色粘球菌(Genbank: ABF89794)以及烟曲霉(Genbank: XM744168 )和黑曲霉(Genbank: AX458699 )的核苷酸序列，然而，除假平胞菌属，盐生盐杆菌和黑曲霉外，其他六种微生物都属于病原性微生物。近年来，脯氨酸特异性内切蛋白酶的研究成为热点，因其在食品行业上具有诱人的应用前景毋庸置疑，已经引起了越来越多国内外食品研究工作者们的青睐。国外已有商业酶应用在啤酒行业中，以抑制瓶装啤酒中混浊的形成，虽然商品酶价格十分昂贵，但在国内仍旧处于垄断地位。究其原因在于食品安全级微生物产脯氨酸特异性内切蛋白酶自然酶活较低，分离纯化困难，基因工程菌研究很少，从而限制了对其生理功能和性质的研究，相应地，国内对该酶的研究也非常滞后，并未建立相关的研究体系。米曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌，从米曲霉中提取脯氨酸特异性内切蛋白酶应用于药品食品行业安全可靠。然而，迄今为止，即使在95年有日本专利显示从产酱油米曲霉菌株中发现具有脯氨酸特异性内切蛋白酶活性，但是国内外有关米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶编码序列和制备方法的报道还未见。因此，研究新型米曲霉脯氨酸特异性内切蛋白酶基因并实现规模化生产具有重要研究意义和应用价值。本研究根据黑曲霉(Genbank: AX458699)和烟曲霉(Genbank:EDP53789)来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白质序列设计引物，从筛选获得的米曲霉中成功调取获得米曲霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，发现其与黑曲霉(Genbank: AX458699 )和烟曲霉(Genbank:EDP53789)来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶蛋白序列的同源性分别仅为19.5%和21%，并验证了其脯氨酸特异性内切蛋白酶功能与应用价值。进一步通过在NCBI上进行BLASTp相似性检索,发现已报道全基因组测序的米曲霉Aspergillus oryzae RIB40中的基因Genbank:XM_001825944.2与本研究调取基因序列一致，其被注释为丝氨酸蛋白酶。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，其核苷酸序列如以下I)或2)所示:I)其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。米曲霉来源的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因产量很低，为实现在毕赤酵母中表达及高效表达，对其原始序列做了部分改造，改造后序列如3)或4)所示；3)其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下1）或2）所示：1）其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列；2）在1）限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种新的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列为SEQID N0.1所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。2.一种改造的脯氨酸特异性内切蛋白酶基因序列，其特征在于其核苷酸序列如以下I)或2)所示: 1)其核苷酸序列为SEQID N0.2所示核苷酸序列； 2)在I)限定的核苷酸序列基础上经碱基的缺失、取代、插入或突变而成且具有编码有活性的脯氨酸特异性内切蛋白酶的核苷酸序列。3.权利要求1，2所述基因编码的蛋白质。4.含有权利要求1，2所述基因的转基因细胞系。5.含有权利要求1，2所述基因的基因工程菌。6.含有权利要求1，2所述基因的表达载体或克隆载体。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐岩，喻晓蔚，康超，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：