本发明专利技术公开了一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，属于遗传工程和酶工程领域。本发明专利技术将来源于P.macerans?strain?JFB05-01(CCTCC?NO:M208063)的环糊精葡萄糖基转移酶作为原始CGTase，通过在原始CGTase的N端分别融合2种自组双亲短肽，构建了两种融合酶——SAP1-CGTase和SAP2-CGTase。与原始CGTase相比，它们以可溶性淀粉为糖基供体时，合成AA-2G产量分别提高了约1.33倍和2.36倍。因此，这些融合酶比原始环糊精葡萄糖基转移酶更利于利用可溶性淀粉为糖基供体生产AA-2G。
【技术实现步骤摘要】
一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶
本专利技术涉及一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，尤其是一种可溶性淀粉底物特异性提高的短肽融合型环糊精糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。
技术介绍
L-抗坏血酸(L-AA，维生素C)是水溶性维生素，参与很多体内的生理活动，在保持和促进人体健康中起到重要的作用，是人体无法自身合成的必需的营养元素。但L-AA极不稳定，在空气中易被氧化为脱氢抗坏血酸，破坏分子中的共轭体系，发生不可逆裂解反应，特别是在空气、光线、热和金属离子的存在下，反应更迅速，使L-AA的生理活性减弱甚至消失，这使得它在应用上受到很大的限制。因此，如何增强L-AA的稳定性是目前国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。2-0- a -D-吡喃型葡萄糖基_L_抗坏血酸(AA-2G)是L-AA的糖基衍生物，是将一个糖基以α -1, 4-糖苷键连接于L-AA的C2位上。由于L-AA的C2位上有糖基掩蔽，不易发生氧化反应，所以在水溶液中特别稳定，并且AA-2G没有直接还原性，有效地保护了 L-AA的生物活性。所以AA-2G是迄今发现的稳定性和性能最佳的L-AA替代品。目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是最常用的催化酶。通常以α _环糊精或β _环糊精为糖基供体，将葡萄糖基催化转移到受体L-AA上。然而，若以α-环糊精为糖基供体，成本太高；若以β-环糊精为糖基供体，由于它的溶解度较低，酶促反应效率受到较大限制。因此，选择一种既便宜又易溶的糖基供体(如可溶性淀粉)将会大大减少AA-2G的生产成本，提高其利润。但是，由于目前环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)对可溶性淀粉的底物特异性(转化率)较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对可溶性淀粉的底物特异性，将推动与L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，尤其是一种可溶性淀粉底物特异性提高的短肽融合型环糊精糖基转移酶；所述短肽融合型环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。所述可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是以Genbank AF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因序列为出发序列，在该酶的N-末端分别融合了两种不同的自组双亲短肽，构建了两种短肽融合型环糊精糖基转移酶=SAPl-CGTase和SAP2_CGTase。所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。所述SAPl-CGTase是融合了序列如SEQ ID N0.3所示自主双亲短肽的CGTase，SAPl-CGTase的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示；所述SAP2_CGTase是融合了序列如SEQID N0.4所示自主双亲短肽的CGTase, SAP2_CGTase的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；。产所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本专利技术要求保护的范围。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下:1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因;2)将步骤1)获得的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)得到基因工程菌。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的生产制备方法，是以产短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶的大肠杆菌基因工程菌为生产菌株，活化后按4%接种量将种子发酵液接到含100 μ g/mL氨苄青霉素的TB液体培养基；在30°C摇床培养至OD600=0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG诱导胞外表达，并在25°C摇床继续培养发酵90h后，将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min除菌体，收集富含环糊精葡萄糖基转移酶的上清液。上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，40C、1000Orpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22 μ m膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A的洗脱，流速lmL/min，检测波长为280nm，分部收集含CGTase酶活的洗脱液；活力组分在50mM磷酸钠缓冲液(pH=6)中透析过夜后，分别得到纯化的融合酶SAPl-CGTase和 SAP2_CGTase。来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans) JFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)，在CGTase的N-末端分别融合两种不同的自组双亲短肽，构建两种短肽融合型CGTase =SAPl-CGTase和SAP2_CGTase，它们相比于原始CGTase利用可溶性淀粉为糖基供体生产AA-2G时，产量分别提高约1.33倍和2.36倍。本专利技术的有益效果:本专利技术构建了 2种短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶，均实现了环糊精糖基转移酶对可溶性淀粉的底物特异性的提高，以此为糖基供体所产AA-2G产量均高于原始CGTase，更利于AA-2G工业化生产。【附图说明】图1 融合酶 SAP-CGTase 的构建示意图；(1):重组质粒 pET_22b (+)/SAP-CGTase ；(2)SAP-CGTase的详细示意图；SAP——自组双亲短肽；CGT——CGTase基因。【具体实施方式】实施例1底物特异性提高的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶本专利技术的短肽融合型环糊精糖基转移酶是在GenBank AF047363.1公布的糊精糖基转移酶的N-末端分别融合了六种不同的自组双亲短肽(SAP)(见表1)，构建了六种融合酶:SAPl-CGTase到SAP6_CGTase。可以通过化学全合成或融合PCR的方式构建上述六种融合酶。短肽融合型环糊精糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(P.macerans)JFB05-0KCCTCCNO:M208063)o表1六种不同的自组双亲短肽的序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是在环糊精葡萄糖基转移酶N?末端融合了自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。
【技术特征摘要】
1.一种可溶性淀粉底物特异性提高的环糊精糖基转移酶，是在环糊精葡萄糖基转移酶N-末端融合了自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。2.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，是以GenbankAF047363.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶基因序列为出发序列，在该酶的N-末端融合自组双亲短肽，构建短肽融合型环糊精糖基转移酶。3.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述短肽融合型环糊精糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。4.根据权利要求1所述的环糊精糖基转移酶，其特征在于，所述自组双亲短肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.3或SEQ ID N0.4所示。5.携带编码权利要求1所述环糊精糖基转移酶的基因的质粒、基因工程菌和转基因细胞系。6.一种产权利要求1所述酶的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下: 1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因； 2)将步骤I)获得的短肽融合型环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体； 3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌Escherichiacoli BL21(DE3)得到基因工程菌。7.一种应用权利要求6所述方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，李江华，韩瑞枝，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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