一种海洋弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海洋弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用，包括如下步骤：（1）将经过活化的深海细菌D25菌株发酵培养后，离心，取上清液，加入硫酸铵，收集沉淀，经重溶、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，制得弹性蛋白酶myroilysin；（2）将弹性蛋白酶myroilysin溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶液；（3）将去除脂肪层和表皮的猪皮浸入酶液中，处理后取出，洗涤，制得猪皮无细胞真皮基质。本发明专利技术所述的海洋来源弹性蛋白酶myroilysin脱细胞和去除弹性蛋白的效率高，速度快，用量小；制备获得的无细胞真皮基质的孔径大，空隙率高，有利于组织工程中细胞的进入和增殖，在组织工程中具有广泛的用途。

【技术实现步骤摘要】
—种海洋弹性蛋白酶myroi Iysin在制备无细胞真皮基质中的应用
本专利技术涉及一种海洋弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用，属于生物技术
。
技术介绍
无细胞真皮基质(acellular dermal matrix, ADM)是近年兴起的新型真皮移植替代材料，由异体或异种皮经过特殊处理制备而成。由于ADM去除了皮肤中的全部细胞成分和部分可溶性蛋白，免疫原性极低，生物相容性极佳，目前在皮肤烧伤治疗、腹壁缺损修补、硬脑膜修复、软硬组织充填和美容整形方面得到广泛应用。ADM的制备方法很多，常用的是酶法和化学方法。常用的化学方法NaOH消蚀法和NaCl-SDS法等，化学方法制备的ADM往往基质中残留了较多的抗原成分，生物相容性欠佳。因此，目前大多采用酶法制备ADM。所用酶类主要为Dispase、胰蛋白酶或复合蛋白酶等。由于这些酶类不能彻底除去细胞和其他抗原成分，酶法一般都配合使用去污剂。例如:Dispase-Triton法,先用Dispase消化皮片，再用Triton-100处理洗漆，去除组织内的细胞和抗原成分；胰蛋白酶-SDS法，先以胰蛋白酶消化皮片，再用SDS液处理洗脱细胞。这些酶法中使用的去污剂可能对ADM中的胶原蛋白有变性破坏作用。虽然目前有Dispase、胰蛋白酶和复合蛋白酶等酶类用于ADM制备中去除细胞，但这些酶类对细胞的去除效率不高，往往需要作用较长时间或多种酶联合使用，还要再用去污剂处理。因此，目前由于缺乏高效的真皮脱细胞蛋白酶，使得ADM的制备方法繁琐，效率低。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种海洋来源的弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用。本专利技术技术方案如下:—种海洋来源的弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用。上述技术方案，包括如下步骤:(I)将经过活化的深海细菌(Myroides profundi) D25菌株接种于液体发酵培养基中发酵培养后，将培养物离心，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度为55%，收集沉淀，经Tris-HCl重溶、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，制得弹性蛋白酶myroilysin ；(2)将步骤(1)制得的弹性蛋白酶myroilysin溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶浓度为0.1~0.2mg/mL的酶液；(3)将去除脂肪层和表皮的猪皮浸入步骤(2)制得的酶液中，处理12~48小时后取出，置于蒸馏水中洗涤24小时，制得猪皮无细胞真皮基质。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，活化为在13~18°C的条件下，在液体种子培养基中培养2~3天。根据本专利技术进一步优选的，上述液体种子培养基组分如下，均为重量份:蛋白胨1份，酵母粉0.5份、人工海水100份，pH为7.5~8.5。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，液体发酵培养基组分如下，均为重量份:豆饼粉2.0份、玉米粉2.0份、麸皮1.0份、KH2PO40.03份、CaCl20.1份、水100份。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，细菌接种量为液体发酵培养基体积的1%。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，发酵培养条件为:在13~18°C、200r/min的条件下振荡培养2~3天；根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(1)中，培养温度为15°C。根据本专利技术进一步优选的，所述步骤(1)中，培养时间为72小时。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，离子交换层析为用DEAE阴离子柱通过O~ 0.8M的NaCl梯度洗脱分离纯化。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，Tris-HCl缓冲液浓度为50mM，pH9.0。根据本专利技术优选的,所述步骤(2)中，蛋白酶myroilysin的酶浓度为0.lmg/ml。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，处理时间为24小时。本专利技术的优良效果:1、本专利技术所述的海洋来源弹性蛋白酶myroilysin可对各种动物皮进行脱细胞处理，该弹性蛋白酶具有膨胀但不降解胶原蛋白的特性；脱细胞和去除弹性蛋白的效率高，速度快，用量小；制备获得的无细胞真皮基质的孔径大，空隙率高，有利于组织工程中细胞的进入和增殖，在组织工程中具有广泛的用途；2、本专利技术所述的海洋弹性蛋白酶myroilysin处理动物皮，由于没有使用化学试剂，制备的无细胞真皮基质无毒害，生物相容性好，原始结构不被破坏，制得的无细胞真皮基质可用于皮肤烧伤治疗、腹壁缺损修补、硬脑膜修复、软硬组织充填和美容整形等领域。【附图说明】:图1、SDS-PAGE分析分离纯化的蛋白酶myroilysin的电泳结果照片；其中:M:marker, A:蛋白酶 myroilysin ;图2、蛋白酶myroilysin、胰蛋白酶，SDS及buffer于37°C处理胶原蛋白1.5h后的照片；其中:A:0.lmg/ml 蛋白酶 myroilysin, B:0.25wt% 膜蛋白酶，C:0.lwt%SDS, D:Buffer ；图3、采用蛋白酶myroilysin处理猪皮制备无细胞真皮基质的膨胀效果图；其中:A:猪皮于37°C在0.lmg/ml的蛋白酶myroilysin中处理5h后的照片，B:37°C下0.lmg/ml蛋白酶myroilysin处理猪皮不同时间后猪皮厚度变化的柱状图；图4、蛋白酶myroilysin去细胞的苏木精_伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining, HE染色)染色的照片；其中:A:对照，B:0.lmg/ml 蛋白酶 myroilysin 处理猪皮 5h, C:0.lmg/ml 胰蛋白酶处理猪皮5h ；图5、蛋白酶myroilysin去弹性蛋白的masson三色染色照片；其中:A:对照，B:0.lmg/ml 蛋白酶 myroilysin 处理猪皮 5h, C:0.lmg/ml 胰蛋白酶处理猪皮5h ；图6、蛋白酶myroilysin对猪皮改性效果的扫描电镜图；其中:A:对照，B:0.lmg/ml蛋白酶myroilysin处理16h后的猪皮。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源:实施例中所述深海适冷菌(Myroides profundi)D25,购自中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC M2012534。实施例1:弹性蛋白酶myroilysin的制备方法,具体包括如下步骤:种子的制备液体种子培养基组分如下，均为重量份:蛋白胨1份，酵母粉0.5份、人工海水100份，pH为7.5~8.5。将上述组分混合后灭菌、冷却即得。将深海适冷菌Myroides profundi D25接种于液体种子培养基中，在15°C条件下震荡培养2天，活化菌种。液体发酵制备胶原蛋白酶制剂液体发酵培养基组分如下，均为重量份:豆饼粉2.0份、玉米粉2.0份、麸皮1.0份、KH2PO40.03份、CaCl20.1份、水100份。将上述组分混合后灭菌，冷却，制得液体发酵培养基。将上述步骤活化的菌种按1% (v/v)的接种量接种于液体发酵培养基中，在15°C，200r/min的条件下，震荡培养72小时，制得发酵液。弹性蛋白酶myroilysin的分离纯化将上述制得的发酵液在4°C, 10000r本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋来源的弹性蛋白酶myroilysin在制备无细胞真皮基质中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种海洋来源的弹性蛋白酶myroiIysin在制备无细胞真皮基质中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤: (1)将经过活化的深海细菌(Myroidesprofundi) D25菌株接种于液体发酵培养基中发酵培养后，将培养物离心，取上清液，向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度为55%，收集沉淀，经Tris-HCl重溶、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，制得弹性蛋白酶myroilysin ； (2)将步骤(1)制得的弹性蛋白酶myroiIysin溶于Tris-HCl缓冲液中，配成酶浓度为0.1~0.2mg/mL的酶液； (3)将去除脂肪层和表皮的猪皮浸入步骤(2)制得的酶液中，处理12~48小时后取出，置于蒸馏水中洗涤24小时，制得猪皮无细胞真皮基质。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，活化为在13~18°C的条件下，在液体种子培养基中培养2~3天。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，上述液体种子培养基组分如下，均为重量份: 蛋白胨1份，酵母粉0.5份、人工海水100份，p...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，石梅，陈秀兰，刘德华，刘畅，解彬彬，苏海楠，张熙颖，王昱凯，周百成，
申请(专利权)人：山东大学，中国大洋矿产资源研究开发协会，
类型：发明
国别省市：