本发明专利技术公开了一种微藻油脂的提取方法和微藻中甘油三酯含量的检测方法，进行微藻油脂提取时，采用了混合溶剂，将混合溶剂与微藻粉混合后进行超声波破壁提取；微藻破壁率高达99%，且破壁时间很短，整个过程提取微藻胞内甘油三酯的效率高。微藻中甘油三酯含量的检测方法采用气相法，气相法能更有效、准确的检测出甘油三酯含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微藻细胞内油脂的提取方法和微藻细胞内所含的甘油三酯含量的检测方法。
技术介绍
世界原油产量持续减少，预计到2018年将下降至75亿桶/年，仅相当于1950年原油产量。随着石油资源日渐枯竭、全球性能源短缺及环境污染等问题日益严重，开发绿色、清洁的生物燃料代替传统化石燃料，已成为国际研究热点。生物柴油是指由植物油、动物脂肪以及微生物胞内油脂与短链醇经酯交换反应得到的有机脂肪酸酯类物质，作为可再生替代能源，环境友好性和可再生性使其具有很强的竞争力。在生物柴油的众多原料中，微藻具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短、油脂面积产率高等特点，被认为是最有潜力替代石油的生物质资源。微藻直接利用阳光、二氧化碳及氮、磷等简单营养物质在胞内合成大量油脂。大多数微藻胞内的油脂组成主要为甘油三酯(含量> 80%)和C14-C22的长链脂肪酸，其中脂肪酸以C16和C18系脂肪酸为主。由于微藻细胞外具有坚韧的细胞壁，因而对微藻细胞内甘油三酯进行提取前首先应该对藻体进行前破壁处理。微藻细胞内甘油三酯的提取率与细胞壁是否完全破碎密切相关。常见破壁方法有研磨、酸热法、藻体自融法、蛋白质溶剂变性法、反复冻融法、超声波破碎等。其中超声波法适合于大多数微藻细胞，超声波对细胞破碎的效率与细胞种类、时间和浓度有关。 微藻细胞破碎后，对微藻细胞内油脂进行提取的方法也至关重要。目前，关于微藻胞内油脂的直接提取方法主要有物理压榨法、有机溶剂提取法、超临界萃取法等。其中，有机溶剂提取法是目前国内外广泛应用的一种方法。例如中国专利文献CN 102816636 A (申请号201210259778.5)公开了一种微藻油脂的提取方法，首先离心收集微藻细胞，经冻干得干藻粉；将干藻粉与酒精混合，经超声处理；将超声处理后的物料加入索氏提取器中，于沸水浴中提取3至4小时，然后经过滤分离、减压浓缩获得微藻油脂。一般来说，所选用的有机溶剂应该力求在提取过程中获得高出油率，同时避免溶剂对人体的伤害，研究表明，单一溶剂很难将微藻胞内油脂提取出来。关于混合溶剂提取方法，中国专利文献CN 102942991 A (申请号201210511744.0)公开了一种微藻油脂提取方法，首先将微藻发酵液进行离心，收集分离之后的微藻细胞；将得到的微藻细胞用缓冲液冲洗，再制成待用藻液；将上述藻液进行2至3次反复冻融，在融化的同时加超声波场；对于冻融后得到的原液，用索氏提取装置采用萃取剂丙三醇:乙醇:石油醚=0.5: 6.5: 3进行提取；最后烘吹除去得到的含有油脂的萃取混合液中的萃取剂。此外，如何准确测定微藻细胞内油脂尤其是甘油三酯含量，是衡量提取方法是否有效的关键。选择快速、简便、高效、灵敏的测定方法具有重要意义。目前最常用的测定方法是荧光测定法。例如中国专利文献CN 103063631 A (申请号201210560247.X)公开了一种溶剂提取-荧光测定微藻油脂含量的方法，首先制作标准曲线:取微藻，离心后收集沉淀，用PBS缓冲液清洗干净后用PBS缓冲液稀释成藻液，作为标准藻液；取5份19.SmL标准藻液，配置不同浓度的三油精溶液；分别往三油精溶液中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，测定各三油精溶液的荧光强度，以吸光度为纵坐标、三油精溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；然后将微藻油脂提取出来；取0.2mL制备的待测溶液加入19.SmL标准藻液中得到样品藻液，将0.2mL正己烷加入19.SmL标准藻液中得到空白样品，分别网样品藻液、空白样品中依次加入二甲基亚砜和尼罗红染色20分钟，分别测定样品藻液、空白样品的荧光强度，样品藻液的荧光强度减去空白样品的荧光强度得到待测溶液的荧光强度，由回归方程计算待测溶液中微藻油脂的浓度。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种油脂提取效率高的微藻油脂的提取方法以及一种更有效、准确检测微藻细胞内甘油三酯含量的方法。实现本专利技术第一目的的技术方案是一种微藻油脂的提取方法，包括以下步骤: ①取微藻培养液离心分离后，去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥，取冻干藻粉于试管中待提取。②将四氢呋喃:氯仿:正己烷按体积比为1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用。③用移液管移取步骤 ②配制的混合溶液，加入步骤①中盛有冻干后藻粉的试管中。④将步骤③获得的藻粉与混合溶液的混合物料在超声波场中进行第一破碎过程，第一破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次持续时间为30~60s，每次间隔时间10~30s。第一破碎过程完毕后离心分离，收集上清液后向离心分离得到的沉淀中加入新鲜的步骤②配制的混合溶液，进行第二破碎过程；第二破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次持续时间为30~60s，每次间隔时间10~30s。第二破碎过程完毕后离心分离，收集上清液；重复第二破碎过程I~2次，将各破碎过程结束后离心分离得到的上清液合并待处理。⑤将步骤④合并的上清液倒入事先准备好的收集瓶中；对收集瓶进行抽真空操作，混合有机溶剂与从微藻中提取出来的油脂分离，收集瓶中剩余的液体即为从微藻中提取的油脂，从而完成微藻油脂的提取。上述步骤③中每Ig冻干后的藻粉加入步骤②配制的20~60mL混合溶液。上述步骤⑤对收集瓶进行抽真空操作时，混合有机溶剂从收集瓶中抽出后进入抽真空装置出气端所连接的回收瓶中，混合有机溶剂收集后可重新用于步骤②至步骤④的破壁提取操作中。上述步骤④中，超声破碎时超声波的频率为20~30kHz。实现本专利技术第二目的的技术方案是一种微藻中甘油三酯含量的检测方法，包括以下步骤: (I)准备待测样溶液，包括以下步骤: ①取微藻培养液离心分离后，去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥，取冻干藻粉0.2g于试管中待提取。②将四氢呋喃:氯仿:正己烷按体积比为1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用。③用移液管移取5mL步骤②配制的混合溶液，加入步骤①中盛有冻干后藻粉的试管中。④将步骤③获得的藻粉与混合溶液的混合物料在超声波场中进行第一破碎过程，第一破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次持续时间为30~60s，每次间隔时间10~30s。第一破碎过程完毕后离心分离，收集上清液后向离心分离得到的沉淀中加入新鲜的步骤②配制的5mL混合溶液，进行第二破碎过程，第二破碎过程的操作与第一破碎过程相同；第二破碎过程完毕后离心分离，收集上清液；重复第二破碎过程I次。⑤将步骤④各破碎过程结束后离心收集的上清液合并后倒入事先准备好的收集瓶中。⑥如果各次上清液合并后体积小于15mL，则用步骤②配制的混合溶液定容至15mL0·(2)配制内标溶液，称取IOmg二十八烷溶于ImL混合溶液中，所述混合溶液为准备待测样溶液时的步骤②配制的混合溶液。(3)配制标准溶液,称量50 μ L十七碳烧,50mg肉豆蘧酸,50mg棕榈酸,20mg豆甾醇和250μ L植物油溶于4 mL混合溶剂中，制成标准溶液；所述混合溶液为准备待测样溶液时的步骤②配制的混合溶液。(4)制作标准曲线，分别从步骤(3)配制的标准溶液中用移液管移取10yL，25 μ L，50 μ L，75 μ L，100 μ L标准溶液至GC管中，并用混合溶液定容至lm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微藻油脂的提取方法，其特征在于包括以下步骤：①取微藻培养液离心分离后，去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥，取冻干藻粉于试管中待提取；②将四氢呋喃∶氯仿∶正己烷按体积比为1∶0.8～1.5∶1～1.2配制混合溶液待用；③用移液管移取步骤②配制的混合溶液，加入步骤①中盛有冻干后藻粉的试管中；④将步骤③获得的藻粉与混合溶液的混合物料在超声波场中进行第一破碎过程，第一破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3～5次，每一次持续时间为30～60s，每次间隔时间10～30s；第一破碎过程完毕后离心分离，收集上清液后向离心分离得到的沉淀中加入新鲜的步骤②配制的混合溶液，进行第二破碎过程；第二破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3～5次，每一次持续时间为30～60s，每次间隔时间10～30s；第二破碎过程完毕后离心分离，收集上清液；重复第二破碎过程1～2次，将各破碎过程结束后离心分离得到的上清液合并待处理；⑤将步骤④合并的上清液倒入事先准备好的收集瓶中；对收集瓶进行抽真空操作，混合有机溶剂与从微藻中提取出来的油脂分离，收集瓶中剩余的液体即为从微藻中提取的油脂，从而完成微藻油脂的提取。
【技术特征摘要】
1.一种微藻油脂的提取方法，其特征在于包括以下步骤: ①取微藻培养液离心分离后，去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥，取冻干藻粉于试管中待提取； ②将四氢呋喃:氯仿:正己烷按体积比为1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用； ③用移液管移取步骤②配制的混合溶液，加入步骤①中盛有冻干后藻粉的试管中； ④将步骤③获得的藻粉与混合溶液的混合物料在超声波场中进行第一破碎过程，第一破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次持续时间为30~60s，每次间隔时间10~30s ； 第一破碎过程完毕后离心分离，收集上清液后向离心分离得到的沉淀中加入新鲜的步骤②配制的混合溶液，进行第二破碎过程；第二破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次持续时间为30~60s，每次间隔时间10~30s ； 第二破碎过程完毕后离心分离，收集上清液；重复第二破碎过程I~2次，将各破碎过程结束后离心分离得到的上清液合并待处理； ⑤将步骤④合并的上清液倒入事先准备好的收集瓶中；对收集瓶进行抽真空操作，混合有机溶剂与从微藻中提取出来的油脂分离，收集瓶中剩余的液体即为从微藻中提取的油月旨，从而完成微藻油脂的提取。2.根据权利要求1所述的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步骤③中每Ig冻干后的藻粉加入步骤②配制的20~60mL混合溶液。3.根据权利要求1所述·的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步骤⑤对收集瓶进行抽真空操作时，混合有机溶剂从收集瓶中抽出后进入抽真空装置出气端所连接的回收瓶中，混合有机溶剂收集后可重新用于步骤②至步骤④的破壁提取操作中。4.根据权利要求1所述的微藻油脂的提取方法，其特征在于:步骤④中，超声破碎时超声波的频率为20~30kHz。5.一种微藻中甘油三酯含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤: (I)准备待测样溶液，包括以下步骤: ①取微藻培养液离心分离后，去除上清液并将获取的微藻进行冷冻干燥，取冻干藻粉·0.2g于试管中待提取； ②将四氢呋喃:氯仿:正己烷按体积比为1: 0.8~1.5: I~1.2配制混合溶液待用； ③用移液管移取5mL步骤②配制的混合溶液，加入步骤①中盛有冻干后藻粉的试管中； ④将步骤③获得的藻粉与混合溶液的混合物料在超声波场中进行第一破碎过程，第一破碎过程中混合物料在超声波场中破碎3~5次，每一次...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁国斌，刘维平，朱政滔，
申请(专利权)人：江苏理工学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。