α-半乳糖苷酶缺陷的治疗制造技术

本发明专利技术提供了高纯度的α-Gal?A及其多种纯化方法；电荷改变的α-Gal?A制剂及其制备方法；在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的α-Gal?A制剂及其制备方法；以及对受治疗者施用α-Gal?A制剂的方法和剂量。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Ct-半乳糖苷酶缺陷的治疗本申请是申请号为00807312.0、申请日为2000年3月9日、专利技术名称为“ a-半乳糖苷酶缺陷的治疗”的中国专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及用于治疗a -半乳糖苷酶A缺陷的方法和组合物。专利技术背景 Fabry病(费勃莱氏病，酰基鞘氨醇己三糖苷酶缺乏症)是X染色体连锁的遗传性溶酶体贮积病，特征为严重的肾损伤、血管角质瘤、和心血管异常(包括心室膨大和二尖瓣闭锁不全)。Fabry病还影响外周神经系统，引起极度痛苦的发作，四肢灼痛。Fabry病是由a-半乳糖苷酶A(a-Gal A)的缺陷引起的。a-Gal A是溶酶体糖水解酶，切割各种复合糖的末端a-半乳糖基部分。Fabry病导致阻断中性糖神经鞘脂一一酰基鞘氨醇己三糖苷(CTH)的分解代谢，并在细胞内和血流中积累这种酶底物。由于这种疾病具有X染色体连锁的遗传模式，大多数Fabry病患者是男性。虽然已经观察到受到严重影响的女性杂合子，但是女性杂合子通常没有症状，或者具有相对较弱的症状(诸如特征性角膜混浊)。剩余a-Gal A活性低、抑或有很微弱的症状抑或表面上没有Fabry病其它特征性症状的非典型性变异型Fabry病，与左心室肥大和心脏病有关Nakano 等人，新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.) 333:288 — 293，(1995)。a -Gal A 的降低可能是这些心脏异常的病因。已经分离得到了编码人a-Gal A的cDNA和基因并进行了测序。人a-Gal A是作为429个氨基酸的多肽表达的，其N末端31个氨基酸为信号肽。人的这种酶已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中(Desnick等人，美国专利5，356，804 ；1annou等人，细胞生物学杂志(J.Cell Biol.) 119:1137，(1992))和昆虫细胞中(Calhoun 等人，WO 90/11353)得到表达。然而，目前的a-Gal A制剂的功效有限。高纯度a-Gal A的制备方法依赖于使用的亲和层析法，即植物凝血素亲和层析法(伴刀豆球蛋白A (ConA) Sepharose?)和基于将a -Gal A与Sepharose?基质偶联的底物类似物N-6-氨基己酰基-a -D-半乳糖基胺的结合的亲和层析法的联合。参阅例如，Bishop等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 256:1307 — 1316,1981)。使用蛋白质性质的植物凝血素亲和树脂和底物类似物树脂通常与亲和剂从固相支持物连续脱落有关(Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.) 201:306 —310，1992)，导致纯化产物中污染了在溶液中游离的或结合了洗脱蛋白质的亲和剂。这些污染使产物不适合用于制药学制剂。结合的底物类似物和植物凝血素也可能对蛋白质的酶学、功能性、和结构特性具有实质性的消极影响。此外，用以前的方法制备的a-Gal A在肝脏中被快速清除。因此，本领域仍然需要使用传统层析树脂的纯化方案，这种树脂可以从供应商处容易地获得，质量适用于大剂量商业用途，而且产生的a-Gal A制剂，不含亲和剂。另外，本领域仍然需要循环半衰期延长、在肝脏以外的特定组织中的摄取增加的a-Gal A制剂。专利技术概述本专利技术提供了高纯度的a-Gal A制剂及用于纯化a-Gal A糖形式的多种方法。本专利技术还提供了电荷改变的a-Gal A制剂及其制备方法。电荷变化是通过增加a-Gal A的唾液酸含量和/或增加a-Gal A的磷酸化来实现的。本专利技术还提供了在哺乳动物宿主中循环半衰期延长的a-Gal A制剂及其制备方法。最后，本专利技术还提供了对受治疗者施用a-Gal A制剂的方法和剂量。本专利技术的a-Gal A可用于治疗Fabry病患者或Fabry病非典型性变异型患者(如主要为心血管异常的特定Fabry病患者群，诸如心室膨大，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣闭锁不全；或者主要为肾累及的患者)。图的简述图1表示用于从人成纤维细胞cDNA文库分离a -Gal A cDNA的2IObp探针(SEQID N0:l)o探针的序列来自a-Gal A基因的外显子7。该探针是通过聚合酶链反应(PCR)由人基因组DNA分离的。图中标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。图2表示完成a-Gal A cDNA克隆5’端的DNA片段的序列(SEQ ID NO:2)。此片段是通过PCR由人基因组DNA扩增的。标有下划线的区域对应于扩增引物的序列。同时还标明了实施例1中所述亚克隆利用的NcoI和SacII限制性内切酶位点的位置。图3表示了 a -Gal A cDNA的序列，包括编码信号肽的序列(SEQ ID NO:3)。图4是a -Gal A表达构建物pXAG_16的示意图，包括CMV(细胞肥大病毒)启动子、第一个外显子、和第一个内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，a-Gal A的cDNA(缺a-Gal A信号肽序列),和hGH3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。图5是a -Gal A表达构建物pXAG_28的示意图，包括胶原蛋白I a 2启动子和第一个外显子，P -肌动蛋白内含子，hGH信号肽编码序列和第一个内含子，a-Gal A的cDNA(缺a -Gal A信号肽序列),和hGH3’UTS。pcDNeo指示了从质粒pcDNeo得到的neo基因的位置。图6表示了人a-Gal A氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。图7表示了编码人a -Gal A的cDNA序列(无信号肽)(SEQ ID NO:5)。图8是使用丁基Sepharose?树脂的a-Gal A纯化步骤的层析图谱。显示了选定的收集液在280nm处的吸光率(普通线)和a -Gal A活性(打点线)。图9是pGA213C的示意图。图10是靶向构建物pGA213C及其与内源a -半乳糖苷酶A基因座进行同源重组的图解。将PGA213C描述成靶向序列，排列于X染色体a-半乳糖苷酶A基因座的相应序列的上面。在线性图谱上面的数字表示的是相对于甲硫氨酸起始密码子ATG的位置。在第-221位的上面显示了含有通过DNA克隆插入该处的鼠dhfr、细菌neo、和CMV启动子/醛缩酶内含子序列的激活单位。a-半乳糖苷酶A编码序列由深色盒表示。a-半乳糖苷酶A非编码基因组序列由浅色盒表示。大箭头表示dhfr和neo表达盒的转录方向。激活的a-半乳糖苷酶A (GA-GAL)基因座图谱下面的分段线表示成功`靶向和基因活化后的GA-GAL mRNA剪接。专利技术详述序言此处所述的专利技术涉及一些新的a -Gal A制剂及其生产方法，以及使用这些制剂治疗Fabry病或非典型性变异型Fabry病患者的方法。下文概述和更详细地说明了某些受到关注的代表性实施方案。本专利技术将在任何细胞(a -Gal A生产细胞)中生产的a -Gal A用于Fabry病的治疗。在优选的实施方案中，本专利技术使用由标准基因工程技术(基于将克隆的a-Gal A基因或cDNA导入宿主细胞)或基因活化方法生产的人a-Gal A。本专利技术提供了含有纯度高于在现有技术中制备的a -Gal A的制剂及其生产方法。如SDS-PAGE或反相HPLC所测量，使用本专利技术的纯化方法，人a本文档来自技高网...

【技术保护点】
含人α?Gal?A制剂的组合物，如SDS?PAGE或反相HPLC测量，纯化至至少99.5％同质性，其中所述制剂包含多种α?Gal?A糖形式且具有至少3.0x106单位/mg蛋白质的比活性，而且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。

【技术特征摘要】
1999.03.11 US 09/266,0141.含人a-Gal A制剂的组合物，如SDS-PAGE或反相HPLC测量，纯化至至少99.5%同质性，其中所述制剂包含多种a-Gal A糖形式且具有至少3.0xlO6单位/mg蛋白质的比活性，而且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。2.权利要求1的组合物，其中所述a-GalA糖形式的寡糖至少35%带电荷。3.权利要求1的组合物，如Z数目测量的，其中所述a-GalA糖形式的寡糖电荷超过150。4.权利要求1的组合物,其中所述a-GalA糖形式的总聚糖至少60%唾液酸化。5.权利要求4的组合物，其中所述制剂的循环半衰期延长。6.用于生产含多种a-GalA糖形式的纯化a-Gal A制剂的方法，所述方法包括下列步骤: a)在平衡缓冲液中于酸性pH使所述a-GalA糖形式结合阳离子交换树脂， b)用所述平衡缓冲液清洗所述树脂以洗脱未结合的物质，并 c)使用选自下组的洗脱溶液洗脱所述a-Gal A糖形式:10 — IOOmM的盐溶液、pH4 —5的缓冲液、及其组合， 其中所述a-Gal A制剂纯化至至少99.5%同质性，且其中所述制剂基本上不含植物凝血素。7.权利要求6的方法，还包 括选自下组的纯化步骤:层析聚焦层析法、金属螯合物亲和层析法、和免疫亲和层析法。8.含多种a-GalA糖形式的a-Gal A制剂，纯化至至少99.5%同质性，由权利要求6的方法生产。9.用于生产寡糖电荷增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括下列步骤: a)将编码GlcNac转移酶III(GnT-1II)的多核苷酸导入a-Gal A生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源GnT-1II基因的表达； b)在能够表达a-Gal A和GnT-1II的培养条件下培养所述a -Gal A生产细胞；并 c)分离a-GalA，其中所述a-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的a-Gal A多。10.权利要求9的方法，其中所述a-GalA制剂的寡糖至少35%带电荷。11.权利要求9的方法，其中所述a-GalA制剂包含多种糖形式，所述糖形式的复合聚糖至少20%含2 — 4个唾液酸残基。12.权利要求9的方法，如Z数目测量的，其中所述a-GalA制剂的寡糖电荷超过150。13.权利要求9的方法，其中所述制剂包含多种糖形式，所述糖形式平均至少25-50%磷酸化。14.寡糖电荷增加、由权利要求9一 13任一项的方法生产的糖基化a-Gal A制剂。15.用于生产寡糖电荷增加的糖基化a-GalA制剂的方法，所述方法包括下列步骤: a)将编码唾液酰基转移酶的多核苷酸导入a-GalA生产细胞，或者通过同源重组导入调控序列以调控内源唾液酰基转移酶的表达； b)在能够表达a-GalA和唾液酰基转移酶的培养条件下培养所述a-Gal A生产细胞；并 c)分离a-GalA，其中所述a-Gal A制剂的寡糖电荷比不含所述多核苷酸的细胞产生的a -Gal A多。16.权利要求15的方法，还包括下列步骤: d)通过分离或纯化步骤(C)的制剂来选择大小或电荷增加的a-Gal A糖形式。17.寡糖电荷增加、由权利要求15或16的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·F·赛尔顿，M·布罗斯克，C·M·克诺施塔，D·A·瑞寇，M·D·维拉姆斯，T·J·舒特兹，P·F·达尼尔，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
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