本发明专利技术提供一种无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中miRNA的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法检测细胞培养基中的miRNA，根据在对照不同细胞类型与状态下miRNA的表达量与所检到的miRNA表达量的关系来判断所检细胞的类型与状态。本发明专利技术的方法首次证明可通过检测培养基中miRNA的表达量判断细胞的类型与状态，包括干细胞的多能性水平和转分化获得的细胞状态等，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的实验与临床方面的应用。
【技术实现步骤摘要】
无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方 法
本专利技术属于生物
,涉及一种检测细胞中miRNA(microRNA)的表达量和确定细胞类型与状态的方法，尤其涉及一种快速、简便、对细胞无损并且可以在培养过程中持续检测干细胞多能性水平和其它细胞类型与状态的方法，具体为利用细胞培养基中微小RNA(microRNA,miRNA)的表达量来判断细胞类型与状态的方法，包括培养不同类型的细胞，收集其培养基，提取培养基中的RNA，反转录，利用荧光定量PCR的方法检测细胞培养基中的miRNA，从而根据标志miRNA的表达量判断干细胞的多能性水平或其他细胞的类型与状态。
技术介绍
miRNA是真核生物基因组中广泛存在的大小约为21~25个碱基的非编码微小RNA。它一般由位于基因间区及内含子中的miRNA基因转录，形成原始miRNA，在动物细胞核内被加工成70nt左右的miRNA前体(pre-miRNA)，再转运到胞质加工为成熟miRNA。成熟miRNA进入miRNA诱导的基因沉默复合物(miRNA-1nduced silencingcomplex;miRISC),与目标mRNA配对,通过降解目标mRNA或阻碍蛋白质翻译来负向调控基因表达(Valencia-Sanchez, Μ.A.，等，Control of translation and mRNA degradationby miRNAs and siRNAs.Genes Dev, 2006.20 (5):p.515-24)。目前的研究已发现人类miRNA有1900多种，这些miRNA参与了人类1/3基因的表达调控，涉及多种关键生命过程。2008 年，Chen 等(Chen, X.，等，Characterization of microRNAs in serum: anovel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.CellRes, 2008.18(10):p.997-1006)用Solexa测序技术证明了人、大鼠、小鼠、牛、马等物种的血清中可以检测到大量的miRNA。之后大量研究结果提示，血清miRNA与肿瘤组织中 miRNA 的表达谱相关(Ng, E.K.，等，Differential expression of microRNAs inplasma of patients with colorectalcancer:a potential marker for colorectalcancer screening.Gut,2009.58(10):p.1375-81 ；Lawrie, C.H.,等,Detection ofelevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients withdiffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol, 2008.141 (5):p.672-5 ；Lawrie, C.H.,等，MicroRNA expression distinguishes between germinal center B cell-likeand activated B cell-like subtypes of diffuse large B cell lymphoma.1nt JCancer, 2007.121 (5):p.1156-61 ；Zhu, ff.,等，Circulating microRNAs in breast cancerand healthy subjects.BMC Res Notes, 2009.2:p.89)。此 Gilad 等(Gilad，S.，等，Serum microRNAs are promising novel biomarkers.PLoS One, 2008.3(9):p.e3148)发现利用实时定量PCR (Quantitative Real-Time RT-PCR，qRT-PCR)技术可以对人体的尿液、唾液、羊水及胸水中的miRNA进行定量。这些发现为研究miRNA开辟了新的途径，证明了体液中普遍含有miRNA。目前研究细胞中miRNA的方法一般都是通过收集破坏细胞提取RNA来实现的。但由于胚胎干细胞、诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)等具有临床应用价值的细胞一般数量有限，并且需要在临床应用前对其细胞特性与状态等特征进行动态检测，收集破坏细胞的方法不仅造成的大量细胞损耗，而且检测结果与继续培养的细胞也具有不一致性，从而成为数量受限的细胞在基础研究与临床应用方面的一个重要瓶颈。针对这一问题，本专利技术首次证明细胞培养基中存在可检测的miRNA，并且其相对表达丰度与细胞中miRNA的相对表达丰度的变化趋势存在一致性。在检测方法方面，本专利技术利用TRIZOL LS进行小分子RNA提取，并利用糖原使RNA可见，从而最大限度地防止了 RNA丢失。利用不同手段转变细胞类型(如将分化的动物成体细胞转变为诱导多能性干细胞(iPS细胞)和不经过干细胞状态的成体细胞转分化)是细胞生物学研究的重要方向，也具有广阔的临床应用前景。但由于目前细胞命运转变方法的诱导周期普遍较长，成功率还很低，如果能够在诱导过程中动态地检测细胞的状态，则可在诱导早期对细胞的特性进行判断，有利于快速筛选出符合要求的目标细胞，具有重要的基础研究与临床应用价值。在本专利技术中，我们通过持续检测小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)诱导成为诱导多能性干细胞(iPS细胞)过程中细胞培养基中miRNA在每一天的表达变化情况，证明细胞培养基中miRNA的表达情况与细胞的类型与状态相一致，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来判断细胞状态和监测细胞类型的转变。
技术实现思路
因而，本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提出了一种检测细胞培养基中miRNA含量的方法，首次证明细胞培养基中miRNA的相对丰度与所培养细胞中miRNA的相对丰度的变化趋势存在一致性，因此可以通过检测细胞培养基中miRNA的表达情况来鉴定细胞的类型与状态，从而避免对细胞的破坏，尤其适用于细胞数量有限的基础研究与临床方面的应用。本专利技术还提供了不同发育潜能的多能性干细胞(2N-1PS细胞为部分多能性细胞，4N-1PS细胞为完全多能性细胞)以及他们的来源细胞培养基中miRNA的表达检测结果，证明培养基中特定miRNA的相对表达量可以指示细胞多能性水平的高低。其中2N-1PS细胞IP20D-3和IP36D-3，4NiPS细胞IP14D-1和IP14D-6来源于小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryo fibroblast, MEF),4N_iPS 细胞 IP16DT-2A 来源于小鼠尾尖成纤维细胞(tail-tipfibroblast, TTF)，4N-1PS细胞IP14DN-5来源于小鼠神经前体细胞(小鼠AM1-3细胞)。除非特别指明，本文中的“Ct值”是指“每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速、简便、对细胞无损地检测细胞中miRNA的表达量和确定细胞类型与状态的方法，其是通过检测细胞培养基中的miRNA的表达量而实现的，所述培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行：1）收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤；2）用步骤1）获得的过滤后的上清液提取RNA；3）将步骤2）提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；4）将步骤3）得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测，从而得到其中miRNA的表达量。
【技术特征摘要】
1.一种快速、简便、对细胞无损地检测细胞中HiiRNA的表达量和确定细胞类型与状态的方法，其是通过检测细胞培养基中的miRNA的表达量而实现的，所述培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行: O收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤； 2)用步骤I)获得的过滤后的上清液提取RNA； 3)将步骤2)提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液； 4)将步骤3)得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测，从而得到其中miRNA的表达量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤I)中，所述细胞选自人或动物胚胎成纤维细胞、人或动物诱导多能性干细胞、动物胚胎干细胞、人或动物成体干细胞、转分化来源的人或动物细胞、人或动物的分化细胞或肿瘤疾病细胞或疾病干细胞中的一种或多种； 优选地，所述动物诱导多能性干细胞选自2N-1PS细胞和4N-1PS细胞，更优选地，所述2N-1PS细胞包括细胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N_iPS细胞包括细胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A 和 IP14DN-5 ； 优选地，所述动物胚胎干细胞为ESC2和/或CLll ; 优选地，所述动物胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞； 优选地，人或动物的分化细胞选自动物尾尖细胞和/或小鼠神经前体细胞，更优选地，所述动物尾尖细胞为小鼠尾尖细胞；所述神经前体细胞为小鼠神经前体细胞； 优选地，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤I)中，当所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖细胞或人乳腺癌细胞时，所述培养细胞的培养基为450ml DMEM加入50mlFBS, 5ml IOOx青链霉素的培养基；或 当所述细胞为小鼠神经前体细胞时，所述培养细胞的培养基为添加有EGF和bFGF的N2B27培养基，优选地，所述EGF和bFGF的浓度均为20ng/ml ;或 当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS诱导多能性干细胞时，所述培养细胞的培养基为含15%FBS的DMEM培养基，优选地，所述DMEM培养基中还添加有1000U的白血病抑制...
【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，王秀杰，张映，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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