本发明专利技术公开了一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用。本发明专利技术利用NCBI上猪相关序列，设计出既有活性又能够进入细胞的DRACO蛋白编码基因，然后在原核表达系统中表达并纯化出DRACO蛋白，在Marc-145细胞水平上通过qRT-PCR、Western-Blot、细胞上清TCID50检测及IFA等方法研究其对HP-PRRSV的抗病毒作用，并进一步阐述DRACO在病毒吸附和进入细胞两个过程中的抗病毒机制。本发明专利技术所述方法制得的DRACO对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物。
【技术实现步骤摘要】
一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用
本专利技术涉及分子生物学领域。更具体地，涉及一种新型药物蛋白DRACO及其在防治猪蓝耳病中的应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse, PRRSV)引起。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus (LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse,HP-PRRSV )。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年龄段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5'和3'非编码区，中间为10个开放阅读框(openreading frame, ORF),其中 0RF2-7 分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP) GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面:(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages, PAMs) , PAMs是免疫细胞,破坏PAMs,从而破坏机体免疫系统,从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；(3)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(4)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；(5)混合感染，目前临床上混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。目前PRRSV防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其中灭活疫苗有如下缺点:(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4 )存在灭活不彻底和散毒的可能。而弱毒疫苗存在毒力返强、重组及潜在感染的危险。故疫苗在防制PRRSV中暴露出越来越多的问题。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有防控PRRSV病毒的疫苗存在的问题，研究寻找一种对PRRSV病毒有很好的抗病毒效果的药物，能够更好地防治猪蓝耳病。本专利技术的目的在于提供一种有活性且能够进入细胞的新型药物蛋白DRACO的编码基因。本专利技术的另一目的在于提供一种有活性且能够进入细胞的新型药物蛋白DRACO。本专利技术的又一目的是提供上述蛋白DRACO在制备抗病毒病药物中的应用。优选地，所述的病毒是在转录和复制过程中能够产生长的dsRNA螺旋区的病毒。更优选地，所述的病毒是PRRSV病毒。上述DRACO基因序列为SEQ ID N0.1所示。DRACO氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示，DRACO蛋白由3部分组成:转导标签、dsRNA检测结构域及细胞凋亡诱导结构域。转导标签为PTD且存在于蛋白N端，氨基酸序列为SEQ ID N0.3。dsRNA检测结构域氨基酸序列为DRACO蛋白氨基酸序列的第14位到第194位，如SEQ ID N0.6，细胞凋亡诱导结构域氨基酸序列为DRACO蛋白氨基酸序列的第195位到第291位，如SEQ ID N0.7。一种原核表达载体，是由出发载体PET-28A的多克隆位点插入DRACO基因序列SEQID N0.1构建而成。一种重组原核表达菌株，含有上述DRACO的编码基因序列。DRACO抗病毒机制为:大部分病毒在转录和复制过程中都会产生长的dsRNA螺旋区，而未被感染的细胞不会产生，故被病毒感染的细胞能被DRACO检测到，启动细胞凋亡信号通路，从而使病毒感染的细胞凋亡，而正常细胞不受影响。PRRSV病毒在转录和复制过程中会产生较长的dsRNA螺旋区，故本专利技术研究DRACO对PRRSV病毒的防治作用，并已在细胞水平证明DRACO对PRRSV有很好的抗病毒效果。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现: 首先根据NCBI上猪的相关基因序列设计DRACO蛋白编码基因，然后利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化出DRACO蛋白 ，进而在细胞水平上研究DRACO对HP-PRRSV的抗病毒效果。具体实验设计如下: 根据 NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)查找获得的猪蛋白激酶 R (ProteinKinase R, PKR)(即dsRNA检测结构域)(序列号为AB104654.1)基因部分序列(如SEQ IDN0.4所不)和细胞凋亡蛋白酶激活因子I (apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1，序列号为AF013263.1)的基因部分序列(如SEQ ID N0.5所示)，N端加上转导肽序列PTD，设计得到DRACO蛋白编码基因，序列为SEQ ID N0.1所示。将设计得到的DRACO序列送生工生物工程(上海)有限公司(http://sangon.com/)合成；将合成得到的DRACO蛋白编码基因克隆到原核表达载体pET_28A，构建得到原核表达载体pET-DRACO，然后在表达菌株BL21 (DE3)中IPTG诱导表达；最后经过纯化得到DRACO蛋白。DRACO细胞毒性试验:AlamarBlue (购自Invitrogen公司)作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光值，制作DRACO细胞毒性图。DRACO抗病毒试验:用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至细胞汇合度为60-70%，弃去培养液，PBS洗3次，分别加入含MOI=0.1和I (空斑形成单位PFU=0.7XTCID50,感染复数MOI=病毒数/细胞数)HP-P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型药物蛋白DRACO的编码基因，其特征在于，DRACO基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种新型药物蛋白DRACO的编码基因，其特征在于，DRACO基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.一种新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，DRACO的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.根据权利要求2所述新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，该蛋白由3部分组成:转导标签、dsRNA检测结构域及细胞凋亡诱导结构域，其中转导标签为PTD且存在于蛋白N端，PTD氨基酸序列为SEQ ID N0.3。4.根据权利要求3所述新型药物蛋白DRAC0，其特征在于，所述的dsRNA检测结构域氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示，细胞凋亡诱导结构域...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘小红，郭春和，莫德林，陈瑶生，高进涛，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：
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