本发明专利技术涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物四项指标HE4、CA125、CEA、TPS的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测四项卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS中的应用。该试剂盒包括：分别抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125、Tb3+标记的抗CEA、Dy3+标记的抗TPS第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。本发明专利技术提供的试剂盒可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对卵巢癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义，同时检测四个肿瘤标志物，简化了检测步骤，提高了检测数据综合分析的特异性和灵敏性。
【技术实现步骤摘要】
—种时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物和医学检测
，具体涉及一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物四项指标HE4、CA125、CEA、TPS的时间分辨荧光免疫检测试剂盒，同时还涉及该试剂盒在综合检测四项卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS中的应用。
技术介绍
卵巢癌发病隐匿，预后差，被形容为最为致命的癌症之一。卵巢癌的早期症状很不明显，初期症状是腹部疼痛或膨胀、肠胃消化不良，不易引起足够重视，一般卵巢癌患者发现时都到了晚期，因此治愈率极低。如果能在早期发现卵巢癌就可大大提高卵巢癌的治愈率，为了达到这一目的，人们进行了大量的研究工作。CA125是1983年由Bast等人从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体0C125结合的一种糖蛋白，存在于上皮性卵巢癌组织和病人的血清中，主要用于辅助诊断恶性浆液性卵巢癌，上皮性卵巢癌，同时也是卵巢癌术后、化疗后疗效观察的指标。CA125是一种诊断卵巢癌和监测其复发最敏感的指标之一，但CA125在患者发病早期往往检测不到，其临床应用有一定的局限性。鉴于此，国内外的专家学者都致力于寻找更为有效的标志物，以便能在早期、更加准确的确诊卵巢癌。目前，国内外很多的专家、学者纷纷以HE4、CA125、CEA、TPS四种指标综合确诊卵巢癌，四种综合的分析在特异性和敏感度上明显高于单一指标。常规实验室或医疗单位用于检测该四项指标通常采用单一试剂盒，即一个试剂盒针对一种肿瘤标记物的检测，此种方式存在的缺点是:1、检测步骤繁多，费时费力；2、四种标记物分别采用4种试剂盒检测，由于不同生产厂家的试剂盒存在差异，且同一厂家的不同试剂盒由于检测的标记物不同可能会存在控制条件、参数的差异而导致检测结果存在误差，此种误差在综合分析四种标记物的特异性和敏感性上会产生较大的影响，可能导致判断结果相差甚远。因此，开发一种能够在相对同一的检测条件下同时能够检测该四种肿瘤标记物的试剂盒，就能降低由于人为原因造成的检测误差，大大提高综合分析检测结果的特异性和敏感性，对下一步的研究或判断做出准确的结论提供更充分的依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的问题，提供一种在同一反应体系内同时综合检测卵巢癌肿瘤标志物四项指标HE4、CA125、CEA、TPS的时间分辨荧光免疫检测试剂盒。本专利技术的目的还在于提供一种该试剂盒的应用。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是:一种时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，把四种卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，该试剂盒包括:分别抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125、Tb3+标记的抗CEA、Dy3+标记的抗TPS第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。其中，所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗HE4、CA125、CEA、TPS的第一株单克隆抗体组成的混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50 μ I的抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100μ I的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板。该微孔板密封于铝箔袋中，4°C保存备用。所述抗体包被液中，分别抗HE4、CA125、CEA、TPS的第一株单克隆抗体的浓度均为0.01 ?0.016g/L。进一步的，所述包被缓冲液的制备方法为:取浓度为0.05mol/L、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得包被缓冲液。所述封板液的制备方法为:向浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入BSA,配制成BSA质量百分比浓度为1%的BSA的PBS缓冲液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得封板液。用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125、Tb3+标记的抗CEA、Dy3+标记的抗TPS第二株单克隆抗体混合抗体的制备方法，其中每种抗体的标记流程步骤相同，只是分别抗HE4、CA125、CEA、TPS的抗体分别对应的稀土离子螯合物标记物为N1-对异硫氰酸苄基-DTTA-Sm、Nl-对异硫氰酸苄基-DTTA_Eu、Nl-对异硫氰酸苄基-DTTA_Tb、Nl-对异硫氰酸苄基-DTTA-Dy，下面把各自的抗体统称为标记抗体，把各自对应的标记物统称为稀土离子螯合物，具体制备方法为:(I)抗体标记前处理用截留分子量为50kDa的离心柱对抗体进行标记前纯化处理，具体步骤如下:悬空加入Img抗体于50kDa的离心柱中，9000rpm离心8分钟，弃掉滤液；往离心柱中加入200 μ I标记缓冲液,9000rpm离心8分钟,弃掉滤液,该步骤重复四次，最后一次将离心管取出，弃掉滤液；往离心柱中加入50 μ I标记缓冲液，让其静置I分钟，然后将离心柱的滤膜反转装入离心管中，8000rpm离心6分钟,收集滤液,即得到待标记的抗体；(2)抗体标记处理称取稀土离子螯合物0.1?0.4mg,加入50?100 μ I超纯水进行溶解；将螯合试剂加入到盛有待标记抗体的EP管中，混合均匀；置于摇床上4°C过夜，制得标记好的抗体；用三倍柱体积的PBS缓冲液作为柱平衡液平衡Superdex 200 IX 30cm柱，用移液器吸取已标记好的抗体缓慢上样，用洗脱液进行洗脱，流速控制在lml/min，蛋白检测仪检测到蛋白峰收集样品，将收集的目的产物经过0.22微米滤膜除菌；用比活度测定方法对标记抗体进行标记率的计算与分析。长期储存标记抗体可以将高纯度的BSA加入到标记抗体溶液中，BSA的终浓度为0.1%，可置于4°C或_20°C进行保存。所述共用荧光增强剂的制备方法为:解离部分:将70?200 μ mol的PTA、2?7 μ mo I的氧化乾、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸调pH值至3.5，制得解离部分；增强部分:将0.1?0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合，用水定容至I升，制得增强部分。所述洗涤液的制备方法为:在浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的PBS缓冲液中加入吐温-20，混匀，制得吐温-20质量百分比浓度为0.05%的PBS溶液，然后用质量百分比浓度为0.2%的NaN3溶液防腐处理，制得洗涤液。所述质控品为HE4、CA125、CEA、TPS标准品的混合物。一种所述的试剂盒在综合检测四项卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS中的应用。试剂盒在综合检测四项卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS中的应用，具体包括以下步骤:(I)用分析缓冲液稀释质控品，制成具有系列浓度梯度包含有HE4、CA125、CEA、TPS四种标准品的混合溶液；(2)将待测样品与步骤(I)制备的四种标准品混合溶液分别加入抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，把四种卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，其特征在于：该试剂盒包括：分别抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125、Tb3+标记的抗CEA、Dy3+标记的抗TPS第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。
【技术特征摘要】
1.一种时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，把四种卵巢癌肿瘤标志物HE4、CA125、CEA、TPS综合在同一微孔的同一反应体系内，采用时间分辨荧光免疫法检测，其特征在于:该试剂盒包括:分别抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板；用Sm3+标记的抗HE4、Eu3+标记的抗CA125、Tb3+标记的抗CEA、Dy3+标记的抗TPS第二株单克隆抗体混合抗体；分析缓冲液；共用荧光增强剂；洗涤液；质控品。2.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，其特征在于:所述的第一株单克隆抗体混合抗体包被的微孔板的制备方法为:把分别抗HE4、CA125、CEA、TPS第一株单克隆抗体混合抗体用包被缓冲液稀释，制得抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50 μ I的所述抗体包被液，于37°C包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100μ I的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得混合抗体包被的微孔板。3.根据权利要求2所述的时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，其特征在于:所述抗体包被液中，分别抗ΗΕ4、CA125、CEA、TPS的第一株单克隆抗体的浓度均为0.01~0.016g/L。4.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法四项综合检测卵巢癌试剂盒，其特征在于:所述共用荧光增强剂的制备方法为:解离部分:将70~200 μ mo I的PTA、2~7 μ mol的氧化宇乙、0.6g的Triton X-100和300ml的乙醇混合,用水定容至I升,用乙酸调pH值至3.5,制得解离部分；增强部分:将0.1~0.4mmol的邻菲罗啉和0.2mol的Tris混合,用水定容至1L，制得增强部分。5.根据权利要求1所述的时间分辨荧光法四项综合检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：王嘎，程自卿，
申请(专利权)人：河南生生医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：
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