本发明专利技术公开了一种鹅组织中多胺（腐胺，亚精胺和精胺）含量的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：C18色谱柱，5μm，4.6×250mm；流动相甲醇：水体积比62∶38；流速1.0mL/min；紫外检测波长229nm；柱温25℃。组织固相萃取方法：将0.1g组织加入1mL，5%的HClO4和10μL内标中匀浆提上清；加入2mL2.5mol/mL的NaOH和1.4μL的苯甲酰氯，40℃水浴30min；调pH值至7.0后，加到C18柱中，15mL水和15mL15%甲醇冲洗；0.5μL甲醇洗脱。本方案可有效分离组织中腐胺、亚精胺和精胺，并能快速、准确检测鹅组织多胺含量，操作简便、准确度高、重复性好。
【技术实现步骤摘要】
一种鹅组织中多胺含量的高效液相色谱检测方法及其应用
本专利技术属于高效液相色谱检测方法，本专利技术涉及的是一种鹅组织中多胺含量的高效液相色谱检测方法及其应用，具体包括鹅组织中多胺的固相萃取方法和高效液相色谱法检测萃取样品中腐胺、亚精胺和精胺的含量。
技术介绍
多胺(包括腐胺、亚精胺和精胺)是一类带有两个或两个以上氨基的低分子脂肪族化合物，它在几乎所有的真核细胞生物体内都有存在，这一进化保守性提示多胺对于细胞存活极为重要。在生理PH下，多胺呈高密度的阳性电荷，它们能与带有大量负电荷的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合并发挥其调控作用。研究表明，多胺可参与调控基因表达和翻译、细胞增殖、细胞信号转导、细胞膜稳定等生命活动过程，并且能够调节某些阳离子通道的活性。近年来，对多胺生物学功能的研究越来越多，研究表明:细胞内多胺浓度降低时，细胞生长缓慢甚至停止；而当细胞内多胺含量过多时，可导致细胞过度增殖。在生长旺盛的组织中多胺的含量高于生长缓慢的组织，癌细胞中的多胺含量远高于其它正常的组织。因此，探寻一种快速、准确检测鹅组织中多胺含量的方法，对于阐明多胺在鹅生命活动过程中所发挥的生物学功能以及调控机理具有重要的理论意义和实际意义。近年来，随着鹅产业的快速发展，鹅产蛋性能较低(一般年产蛋量仅为30-80枚)已成为制约鹅产业化发展的重要因素 ，是鹅产业亟待解决的关键问题之一。鹅产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。鹅卵泡经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系，原始卵泡经等级前发育进入小黄卵泡库，随后被选择并进入等级发育。家禽可通过调控起始发育卵泡的数量和小卵泡(白卵泡和小黄卵泡)的闭锁来调节卵巢的功能，同时还可通过闭锁机制清除排卵前卵泡来调节排卵的速率，进而影响家禽的产蛋性能。研究表明，小鼠体内多胺含量减少时，能够使小鼠卵泡发育停滞并出现闭锁。另外，多胺能够调控非洲爪蟾卵母细胞的形成，调控生殖类激素合成酶的表达。处于繁殖期的鹅卵巢组织是生长速度最快的组织之一，且组织中多胺的浓度对卵泡的发育起了至关重要的作用。所以，快速、准确的检测鹅卵泡组织中多胺的含量对与鹅繁殖相关研究具有重要的理论意义和现实意义。固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程。由于鹅组织中的多胺存在于组织中，无法直接运用液相色谱检测，需要通过固相萃取以及衍生化反应后才能被液相色谱的紫外检测器特定波段下的紫外线检测到，所以要将组织研磨并用5 %的此104抽提组织中的多胺，之后与苯甲酰氯衍生再用C18固相萃取柱萃取衍生后的多胺。固相萃取的方法繁琐并很容易由于操作上的失误导致萃取不成功或萃取不完全，本方案提供了完整的、可行的鹅组织中萃取多胺的方法，该方法操作简单、切实可行。高效液相色谱检测具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高、应用范围广等特点， 但高效液相色谱检测时必须对检测条件进行优化，检测条件不够好会导致高效液相色谱检 测是出峰时间分不开，检测重复性不好等问题。本专利技术方案提供了多胺衍生物高效液相色 谱检测的优化方案，色谱条件为:色谱柱SWEEL Chromstar?C18,5 u m，4.6X250 mm ;流动 相比例甲醇:水=62:38 (V/V);流速1.0 mL/min ;紫外检测器检测波长为229 mm ;进样体 积20 L ;柱温为25°C。本方案色谱条件能够准确分开组织中腐胺、亚精胺和精胺衍生物 的出峰时间并且具有较高的重复性。为阐明鹅体内多胺含量、多胺生物学功能及其调控机理，寻找快速、准确的检测鹅 组织中多胺含量的方法是鹅体内多胺相关研究得以开展的关键环节。本专利技术公开了鹅组织 中多胺的固相萃取方案以及多胺高效液相色谱检测的色谱条件，同时应用该专利技术方案检测 了鹅卵泡组织中的多胺含量。本专利技术方案切实可行，操作简单，重复性高。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于从鹅组织中固相萃取腐胺，亚精胺和精胺。该方法操作简 单，切实可行，具有较高的重复性。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为。用5 %的HClO4将鹅组织中的多胺抽提出来，再在碱性条件下(加入与萃取液等体 积的2.5 mol/L NaOH)与苯甲酰氯发生衍生反应，使多胺生成强紫外吸收的苯甲酸脂类多 胺衍生物，之后经过C18固相萃取柱将衍生液中的苯甲酸脂类多胺衍生物浓缩，萃取，洗去 杂质，色谱级甲醇洗脱步骤，将鹅组织中的多胺转化为可以采用高效液相色谱紫外检测器 检测到的液态物质。本专利技术的目的之二在于提供一种高效液相色谱法检测鹅组织中多胺检测的优化 后的色谱条件，该方法能使腐胺，亚精胺和精胺的衍生物分离情况较好，可重复性强。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为。采用的色谱条件为:(1)色谱柱SWEEL Chromstar?C18，5 u m,4.6X250 mm；(2) 流动相比例为:甲醇:水=62:38 (V/V) ;(3)流速为:1.0 mL/min; (4)紫外检测器检测波 长为229 nm ;(5)进样体积为20 y L ; (6)柱温为25°C。本专利技术专利公开了一种从鹅组织中萃取衍生多胺并用高效液相色谱检测组织中 多胺的方法，多胺在鹅生命活动过程中起了至关重要的作用，了解多胺在鹅组织中的含量， 从而揭示多胺含量与鹅生命活动的生理机制有重要的理论意义和现实意义。本方案具有可 操作性强，方法切实可行，可重复性高等优点。【附图说明】图1腐胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出腐胺和内标1，6-己二胺分峰 良好，腐胺在6.4 min,内标1，6-己二胺在8.7 min。图2亚精胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出内标1，6-己二胺和亚精胺 分峰良好，1,6-己二胺在8.7 min,亚精胺在10.1 min。图3精胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出内标1，6-己二胺和精胺分峰 良好，I, 6-己二胺在8.7 min,精胺在16.1 min。图4正常发育卵泡的色谱峰图。腐胺，内标1，6-己二胺，亚精胺和精胺分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致。图5闭锁卵泡的色谱峰图。腐胺，内标1，6-己二胺，亚精胺和精胺分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致。图6最大的排卵前卵泡和闭锁卵泡中多胺的含量。【具体实施方式】以下结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述，但不应将此理解为本专利技术的范围仅限于下述实施例。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。仪器与试剂。安捷伦1100 (美国加州)高效液相色谱仪；紫外检测器；色谱柱SWEELChromstarTMC18, 5 μ m, 4.6X250 mm ;万分之一电子天平；KQ_300DA型数控超声波清洗器；Thermo离心机，水浴锅，Thermo Hypersep C18固相萃取柱；超纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鹅组织多胺含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于该方法的色谱条件为：（1）色谱柱SWEEL?ChromstarTMC18，5?μm，4.6×250?mm；（2）流动相比例为：甲醇:水=62:38（V/V）；（3）流速为：1.0?mL/min；（4）紫外检测器检测波长为229?nm；（6）柱温为25℃。
【技术特征摘要】
1.一种鹅组织多胺含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于该方法的色谱条件为:(1)色谱柱SWEEL Chromstar TMC18, 5 u m, 4.6X250 mm;(2)流动相比例为:甲醇:水=62:38(V/V)；(3)流速为:1.0 mL/min ；(4)紫外检测器检测波长为229nm ；(6)柱温为25。。。2.一种鹅组织中多胺固相萃取的方法，其特征在于该方法的操作步骤为:(1)取鹅组织样，在液氮中研成粉末状，称取0.1 g组织；(2)向组织中加入ImL 5 %的HClO4，再加入10 ii L的内标(1，6-己二胺)匀浆2次；(3)向匀浆液中加入2mL的2.5 mo I/L NaOH和1.4 y L的苯甲酰氯，漩涡震荡混匀， 40°C水浴衍生30 min ；(4)用6mo I/L的HCl调节衍生液的pH值到7.0 ；(5)将调节好...
【专利技术属性】
技术研发人员：康波，姜冬梅，何珲，王继文，马容，李亮，王迅，韩春春，刘贺贺，许恒勇，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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