本发明专利技术公开了检测类禽型H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒。所述引物为两对：针对H1基因的引物和针对N1基因的引物，所述针对H1基因引物的上游引物Hu核苷酸序列为5’-GACTCTAGATTTCCATGACCTT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5’-ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3’；所述针对N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’-TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’，下游引物Nd核苷酸序列为5’-GACCAAGCGACTGACTCAA-3’，所述试剂盒包括所述的引物。采用本发明专利技术引物检测类禽型H1N1猪流感病毒，具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点。
【技术实现步骤摘要】
检测类禽型H1N1猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒
本专利技术属于动物病毒分子生物检测
，具体涉及检测类禽型HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒。
技术介绍
HlNl 亚型猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)是猪流感(Swineinfluenza, SI)的重要病原之一，为正粘病毒科、A型流感病毒属，由8个分节段的基因组构成，共编码10-11种蛋白。HINl亚型猪流感1918年美国最先报道，Shope于1930年第一次分离鉴定该亚型病毒，这也是首次确诊猪流感病毒，此后不断传播，现已在五大洲都发现其踪迹。该病毒可感染猪，引起猪发生急性、热性呼吸器官传染病，主要以突发的呼吸系统并转归迅速的综合症状为特征，是猪呼吸道综合征症候群疾病之一。由于猪流感病毒对呼吸道上皮细胞具有亲嗜特性，可对其造成损伤，在临床上猪群的发病率可高达100 %，病死率 如伴随其他呼吸系统疾病的继发、混合感染，会导致猪群的损伤程度和病死率会大幅度增高。目前，从猪体中分离到流感病毒有HlNl、H1N2、H3N2、H1N7、H4N6、H3N6、H5N1和H9N2等多个亚型的病毒，能引起猪流感症状并在当今猪群中传播主要有3个亚型，H1N1、H3N2和H1N2，而HlNl在猪流感病毒中占优势地位，近些年世界各地分离到的猪流感病毒亚型大部分都是HlNl。Sreta等研究发现HlNl致病力较其它猪流感病毒更强，感染断奶乳猪仔猪的肺损伤度比H3N2的严重，极大危害猪群的健康。值得注意的是，已有报道美国于2005年12月至2009年2月出现的10例HlNl亚型和I例是H1N2猪流感病毒感染人病例，其中证实9例与猪有直接接触史，2009年3月始发于墨西哥的21世纪甲型HlNl流感大流行，令此亚型流感病毒愈加受到高度的重视。 HlNl猪流感根据病毒基因片段来源不同，可分为古典型HlNl猪流感、类禽型HlNl猪流感和类人型HlNl猪流感。三类HlNl猪流感病毒在世界各地处于不同阶段的流行情况各不相同。在二十世纪七十年代末欧洲大陆暴发HlNl猪流感事件，所引发的病原是由野鸭传给猪群的完整的禽流感病毒。该病毒首次于1979年在匈牙利检测到，各个基因节段均来自禽中的HlNl流感病毒，此类病毒的抗原性和遗传性都有别于古典HlNl病毒，证明HlNl亚型禽流感病毒跨种属传播至猪群。因此，将这类病毒称为类禽型HINl猪流感病毒。此后禽源的HlNl猪流感病毒已普遍传播在欧洲国家和地区，正逐渐取代古典型HlNl猪流感病毒而成为猪群中HlNl亚型病毒的主要流行毒株。不久后该病毒基因组出现了重组，1984年欧洲猪群流行含有表面基因HA、NA来自人H3N2、H1N2亚型，其他6个内部基因片段出自类禽HlNl亚型的重组新毒株H3N2，从此作为人畜共患病的病原，流行至今；欧洲禽源HlNl猪流感毒株的出现，逐渐替代古典型HlNl亚型SIV成为主要的流行毒株，并引起广泛传播，在一定程度上体现禽源HlNl亚型猪流感病毒的选择优势比古典HlNl亚型SIV明显。1992年香港猪群中分离到禽源的猪流感H1N1，2006年中国大陆出现类禽HlNl亚型猪流感病毒，并开始在猪群中扮演流行主角，到2008年中国从病猪群中又分离鉴定出10株欧系类禽型HlNl猪流感病毒，意味着类禽型HlNl亚型猪流感病毒与古典型HlNl亚型猪流感病毒共同流行在中国猪群中，形成了欧亚类禽型的一个亚洲分支。但类禽型HlNl猪流感尚没有出现在北美洲猪群中，该毒株只持续在欧亚大陆传播，在欧亚大陆外未曾报道，亦名欧亚猪流感HlNI病毒。1986年欧洲地区人群发生感染类禽猪流感病毒事件，至今，已有8起类禽HlNl亚型及类禽H3N2三重重组病毒感染的病例。1993年新西兰儿童感染了从猪只分离到的H3N2亚型重组流感病毒，并从病人肺部分离到禽源的HlNl亚型猪流感病毒。2010年12月，中国大陆一儿童感染了欧亚系类禽型HlNI SIV感染儿童病例，在紧随其后的监测中从患者家养殖的猪体内分离到该病毒，并从当地的生猪屠宰场样品中也分离到与该毒株同源率极高的猪流感病毒，说明该病毒流行于当地的猪群，成为此病患者的感染源。类禽型HlNl流感病毒可能会通过在猪体内的适应，再传播给人类造成在人群中的流行。因此建立有效的诊断方法对防治HlNl亚型猪流感具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供检测类禽型HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物及试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。本专利技术的技术方案为:检测类禽型HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物，所述引物为两对:针对Hl基因的引物和针对NI基因的引物，所述针对Hl基因引物的上游引物Hu核苷酸序列为5’ -GACTCTAGATTTCCATGACCTT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为5 ’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3 ’；所述针对NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’ -TCCAAGGGGGATGTGITTG-3’，下游引物 Nd 核苷酸序列为 5’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。以上所述检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包括以上所述的引物。以上所述检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，所述试剂盒还包括:RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。所述RNA提取试剂包括=Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；所述RT 反应试剂包括:5 Xbuffer 缓冲液、dNTPs、HIR、Uni 12 ；所述PCR 反应试剂包括:Taq DNA 酶、10 Xbuffer 缓冲液、dNTPs, MgCl2 和 cDNA ；所述阴性对照包括:DEPC水；所述阳性对照包括:类禽型HlNl猪流感病毒。所述类禽型HlNl猪流感病毒可为类禽型HlNl猪流感毒株，如:广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存的类禽型HlNl猪流感毒株。本专利技术的具体原理是类禽型HlNl猪流感病毒的同源性，应用0LIG6.0软件，合成针对H基因和N基因的两对靶核苷酸序列的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出特异性的目的带。试验方法及过程如下:1.引物设计:PCR反应中有两条引物，即Y端引物和:V引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准)，5'端引物与位于待扩增片段5'端上的一小段DNA序列相同；3'端引物与位于待扩增片段3'端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对口蹄疫A型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下:Hl 基因上游引物 Hu 序列:5’ -GACTCTAGATTTCCATGACCTT-3’ ；[0021 ]下游引物 Hd 序列:5 ’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3 ’。NI 基因上游引物 Nu 序列:5’ -TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3’ ；下游引物Nd 序列:5 ’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。2.反应体系的建立和优化:将灭活的待检样品用Trizo本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测类禽型H1N1猪流感病毒的RT?PCR引物，其特征在于，所述引物为两对：针对H1基因的引物和针对N1基因的引物，所述针对H1基因引物的上游引物Hu核苷酸序列为5’?GACTCTAGATTTCCATGACCTT?3’，下游引物Hd核苷酸序列为?5’?ACCCATTAGAACACATCCAGAA?3’；所述针对N1基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为5’?TCCAAGGGGGATGTGTTTG?3’，下游引物Nd核苷酸序列为?5’?GACCAAGCGACTGACTCAA?3’。
【技术特征摘要】
1.检测类禽型HlNl猪流感病毒的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物为两对:针对Hl基因的引物和针对NI基因的引物，所述针对Hl基因引物的上游引物Hu核苷酸序列为5’ -GACTCTAGATTTCCATGACCTT-3’，下游引物Hd核苷酸序列为.5 ’ -ACCCATTAGAACACATCCAGAA-3 ’；所述针对NI基因引物的上游引物Nu核苷酸序列为.5 ’ -TCCAAGGGGGATGTGTTTG-3，，下游引物 Nd 核苷酸序列为 5 ’ -GACCAAGCGACTGACTCAA-3 ’。2.一种检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求I所述的引物。3.根据权利要求2所述检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。4.根据权利要求3所述检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于: (1)所述RNA提取试剂包括=Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇； (2)所述RT反应试剂包括:5Xbuffer缓冲液、dNTPs、HIR、Uni12 ； (3)所述PCR 反应试剂包括:Taq DNA 酶、IOXbuffer 缓冲液、dNTPs,MgCl2 和 cDNA ； (4)所述阴性对照包括:DEPC水； (5)所述阳性对照包括:类禽型HlNl猪流感病毒。5.根据权利要求4所述检测类禽型HlNl猪流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述类禽型HlNl猪流感病毒为类禽型HlNl猪流感毒株。6.一种如权利要求4或5所述检测类禽型HlNl猪流...
【专利技术属性】
技术研发人员：颜健华，熊毅，冯淑萍，孙翔翔，李春英，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：
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