一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法技术

一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，本发明专利技术包括如下步骤：1)样品DNA提取：对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；2)按顺序使用pL28l／DS48引物、pDGSL313一l／pS48引物、pDGSL719-2／pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；4)获得云南松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。本发明专利技术提供一种针对中国云南松茸主产区松茸的地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残留监控中的问题松茸的云南原产地溯源提供理论参考依据。

【技术实现步骤摘要】
—种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法
本专利技术涉及一种松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，尤其涉及的是中国云南松茸主产区的松茸产地属性的DNA指纹图谱的建立方法。
技术介绍
松鸾隶属担子菌门(Basidiomycota)、担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口薦科(Tricholoma)、口薦属(Tricholoma) [1]。全球已报道了 15 个种，我国已记载了 5个种一个变种，即松鸾(T.matsutake)、假松鸾(T.bakamatsukake)、青岗覃(T.quercicola)、粗壮口蘑(T.robustum)、黄褐口蘑(T.fulvoeastaneum)和台湾松鸾变种(T.matsutake),松鸾是一种外生菌根真菌类，由菌丝体、子实体和孢子组成,本专利技术所指的松茸是T.matsutake这个品种，且指可食用的子实体部分，也就是人们在市场上见到的松茸菌。松茸是一种味道鲜美、口感上乘、气味浓郁独特、营养价值高、具有食疗效果的纯天然食用菌。目前尚不能人工驯化栽培，基本上都野生菌，所以来自不同分布区域的松茸拥有产地属性。本专利技术只针对新鲜松茸，松茸加工制品中，DNA可能发生断裂和降解，且目前多数松茸加工品不具有产地属性，没有对其进行产地溯源的需要。日本是松茸的最大消费国，也是最大的进口国。我国松茸主要出口至日本，其中鲜松茸的出口量占日本进口量的43%，具有巨大的海外贸易价值。我国松茸的主产区是云南、四川、吉林和黑龙江，其中云南的产量最大。目前东北生产的鲜松鸾从吉林口岸出口，云南、四川和西藏鲜松鸾从云南出入境口岸出口，但有时东北产的松茸也会从云南口岸出口。年平均统计数据显示:云南口岸出口的鲜松茸量平均占中国出口的鲜松茸量的71%，甚至有时可占占全国出口量的85%，居全国之首。中国云南地区的松茸的主要分布在云南的迪庆州、大理州、楚雄州、怒江州的海拔为2000-4000米的原始森林区。交通不便，气候寒冷，人烟稀少，多是高山少数名族居住于附近。目前多是由当地高山贫困少数民族开始对其进行采摘并卖给当地的松茸出口收购商，这已成为这些少数民族脱贫致富的主要经济来源。因此，松茸的顺利出口关系到这些边疆少数民族的经济收入，关系到边疆地区的民族团结和政治稳定。松茸虽然是纯天然的野生食用菌 ，但是生长地分散，采摘人员多半是居住于附近的当地居民——散户，从采撷到出口还要经历很多环节，面对出口国特别是日本苛刻的进口食品贸易壁垒，检验检疫部门必须对松茸的采摘到出口的全过程进行质量安全控制和溯源管理，尽可能保证松茸的顺利出口。另外，日本也要求我国提供对日出口的松茸的官方原产地证明。中国国家质量监督检验检疫总局制定了《出口鲜松茸质量安全控制要求》指出“在强化检验把关中指出“指导出口企业避免从农残和重金属污染严重的地区收购原料，降低农残和重金属含量超标的风险”。虽然检验检疫监督管理部门按照溯源管理措施，要求企业对产地进行编号管理，按照原料来源分产地加工、存储堆放，在报检时必须提供该批出口松茸原料溯源管理网络图，但实际情况是企业履行得并不严格，这给经出口口岸检验检疫部门检验发现残留监控不合格的松茸的溯源造成困难，为了保护云南口岸出口的持续性，以及更有效、更有针对性对某个地区进行松茸质量的管理，管理监管部门除了依靠企业诚信备案登记外，还需要能识别松茸的产地属性的技术手段，用于区别产地来自不同云南产地的松茸货品。中国整个西南地区的松茸外观相近，气味相同，微有口感上的差异，且不同成熟期松茸子实体外观会发生变化，受此影响，仅从感官判断不易辨别产地。王明富等研究者就认为中国西南地区的松茸和日本的松茸即使地理跨度较大，但形态接近，菌丝体不拮抗，属同一品系的松鸾。以松茸含有的总蛋白以及多糖类进行分析，这些营养物质在松茸的不同成熟期表达量的不同，受此影响，由此得到的化学分析数据不能用于产地溯源。相对于感官以及营养成分的分析，遗传物质的特性不会随着菌体生长而发生显著改变，相对于一个个体，遗传物质从幼到老基本都是稳定的。但沙涛等认为滇产松茸的IGS1-RFLP与日产松茸的主要类型十分相似，认为滇产的和日产的松茸可能是同源的。直到Murata等(2008)创建了并运用这两套引物pDGSL313_l/pS48和pDGSL719-2/pS48,序列为:pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;采用琼脂糖凝胶电泳技术，对日本、北朝鲜、中国东北省区、中国西南省区、不丹的松茸进行了地理原产地的追溯，开创了利用遗传物质进行松茸原产地溯源的局面。其中对中国东北省的松茸进行pDGSL719-2/pS48的PCR扩增有PCR产物，而对中国西南省区的松茸进行pDGSL719_2/PS48的PCR扩增没有PCR产物，这是区分中国西南省区和东北省区的松茸关键。琼脂糖凝胶电泳技术电泳方法自身重复性不佳、分辨率低下、操作时间长，操作人员易接触可能致畸的基因染料，不适宜将来运用于新鲜松茸的溯源检测过程。全自动DNA分析系统基于全自动毛细管电泳的原理，是一种用样量少，环境友好，操作快速，分辨率高，电泳条件固定的PCR产物分离系统，所得出的DNA指纹图谱在数据的重复性和稳定性、量化确定性、以及质量的控制等方面都比琼脂糖凝胶电泳技术得出的DNA指纹图谱更加可靠。 Murata 等(2006)设计的 pL281/pS48PCR 反应系统，序列为 pL281:CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ；利用一对引物就可以得到丰富的遗传多态信息，当时Murata等用于区分是否为T.matsutake类的松鸾并未用这套引物进行松鸾原产地的追溯。目前除本专利技术外无任何学者对中国云南松茸主产区的松茸建立过产地属性的DNA指纹图谱。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对出口松茸的原产地溯源管理的现实需求，补填我国目前没有对中国云南松茸原产地溯源的DNA技术的缺口，提供一种针对中国云南松茸主产区松茸的地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残留监控中的问题松茸的云南原产地溯源提供理论参考依据。本专利技术的中国云南松茸产地属性DNA指纹图谱的建立具体包括下列步骤:一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为:PL281:CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步骤:I)样品DNA提取:对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；2)按顺序使用 p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、pDGSL313?1/pS48引物、pDGSL719?2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为：pL281：CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG；pS48：GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC；pDGSL313?1：CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT；pDGSL719?2：TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT；其特征在于，包括如下步骤：1）样品DNA提取：对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；2）按顺序使用pL281/pS48引物、pDGSL313?1/pS48引物、pDGSL719?2/pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；3）运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；4）获得云南松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。

【技术特征摘要】
1.一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、 pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为:pL281:CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2: TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步骤: 1)样品DNA提取:对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取； 2)按顺序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增； 3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测； 4)获得云南松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。2.根据权利要求1所述的一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法的具体参数为， 1)样品DNA提取:取每个地区的鲜松茸样本菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性指套中捻碎；必须选择使用非过柱离心的可破碎细胞壁的商业DNA提取试剂盒提取新鲜样本的DNA ； 2)按顺序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；其中，PCR的反应体系和检测条件:Premix TaqVersion2.0lO y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M，DNA25_50ng，补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64°C，pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5 °C ； 3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测:pDGSL719_2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screen...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈丽萍，陈芸，刘忠民，赵永昌，陈立佼，陈卫民，李树红，岳亮亮，李旻，丁元明，杨玲春，滕平，王裔耿，李云飞，殷红，陈宏仙，颜庆，傅士华，
申请(专利权)人：云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：