基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，包括：选定外参基因；配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；样品中加入预混合液，收集样品RNA和DNA；实时定量荧光PCR，检测待测基因和内参基因RNA拷贝数、内参基因DNA拷贝数以及外参基因RNA和DNA拷贝数，计算得到内参基因的表观表达水平后，再根据公式得到待测基因的表达校准值。本发明专利技术还公开了上述方法在PCR?array以及表达谱芯片检测分析技术中的应用。本发明专利技术将基因的表观表达水平概念和检测方法与传统表达检测体系相结合，以更少的检测反应、更低廉的成本实现更精确的基因表达水平检测，修正由内参基因真实表达水平在不同样本间不恒定所造成的检测结果的不准确。

【技术实现步骤摘要】
基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的检测方法
本专利技术涉及分子生物学及生物信息学领域，具体涉及一种改进的、基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR的基因表达校准值的检测方法。
技术介绍
自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。Northern杂交方法是最早用来测定基因转录水平的方法。后来,结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR(reverse transcription-PCR,即:逆转录-聚合酶链式反应)提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。近年来，实时定量聚合酶链式反应(简称为:qPCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主流方法。上述方法为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常将待测基因的转录水平表示为与一个参考值(内参基因RNA水平、细胞内总RNA水平)的相对表达量。内参通常为看家基因，如:β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，众所周知，不同组织、或同一组织在不同条件下，细胞的总RNA量和/或内参的量并不恒定，因此，基于该前提所进行的基因转录水平检测往往不够精确。针对这一问题，我们曾经提出RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法[1](专利号:ZL200910049306.5)，检测基因在某个时刻、某个细胞状态下的RNA和DNA的比值，确定待测基因的表观表达水平。然而在“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”中，针对每个待测基因都需要同时检测其RNA和DNA水平，因此检测反应需要加倍，成本大大增加，限制了它的可推广性。如何将“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法”与传统技术平台进行整合和改良，以合理的成本获得更加可靠的基因表达数据，是目前亟待解决的技术问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提出的基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，是在传统基因表达检测体系的基础上，运用我们曾经提出的专利“ RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法” [1](专利号:ZL200910049306.5)，增加检测原有体系中内参基因的转录产物拷贝数和基因拷贝数，以及外参基因的转录产物拷贝数和基因拷贝数，计算内参基因的表观表达水平，进而对所有待测基因的表达值进行校准，从而得到所有待测基因的表达校准值。本专利技术的目的之一是提供一种改进的、基于RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR策略的基因表达校准值的检测方法，得到待测基因的表达校准值，包括步骤如下:I)选定外参基因，制备外参基因的RNA与DNA，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；其中，所述外参基因的选定原则及预混液的配制原则与专利“RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用”(专利号:ZL200910049306.5)中的原则一致。2)将步骤I)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA ；3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；4)对cDNA组分和总DNA组分分别进行实时定量荧光PCR扩增。除测定待测基因和原有检测体系中内参基因的RNA拷贝数外，进一步测定内参基因的DNA扩增产物的拷贝数、以及外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数，根据如下公式计算得到内参基因的表观表达水平:本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：?1)选定外参基因，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；?2)将步骤1)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA；?3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链；?4)对cDNA组分和总DNA组分分别进行实时定量荧光PCR扩增，测定扩增后的待测基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的DNA扩增产物的拷贝数、以及外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数；?根据如下公式计算得到内参基因的表观表达水平：?根据上述内参基因的表观表达水平值，按如下公式计算得到待测基因的表达校准值：?。FDA0000419414380000011.jpg,FDA0000419414380000012.jpg

【技术特征摘要】
1.基于RNA和DNA双外参实时定量PCR的表达校准值的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)选定外参基因，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液； 2)将步骤I)制备的预混合液与待测样品混合，分别抽提总RNA和总DNA； 3)总RNA进行逆转录合成第一条cDNA链； 4)对cDNA组分和总DNA组分分别进行实时定量荧光PCR扩增，测定扩增后的待测基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的RNA扩增产物拷贝数、内参基因的DNA扩增产物的拷贝数、以及外参基因的RNA和DNA扩增产物的拷贝数； 根据如下公式计算得到内参基因的表观表达水平: ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆长德，李园园，
申请(专利权)人：上海生物信息技术研究中心，
类型：发明
国别省市：