一组用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记制造技术

本发明专利技术涉及一组用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记。该微卫星分子标记包括HZs01、HZs02、HZs03、HZs04、HZs05、HZs06、HZs07。其中HZs01、HZs02、HZs03、HZs04为硬脚铁皮石斛特有序列，HZs05、HZs06、HZs07为软脚铁皮石斛特有序列。本发明专利技术获得的硬脚铁皮石斛和软脚铁皮石斛特有的微卫星分子标记，可以用于硬脚和软脚铁皮石斛的区分，用于商业打假和铁皮枫斗的药材鉴定。本发明专利技术可利用这些微卫星分子标记区别硬脚铁皮石斛和软脚铁皮石斛，重复性好，是一种可靠有效的DNA分子标记。

【技术实现步骤摘要】
一组用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记
本专利技术属于植物基因组DNA分子标记
，具体涉及一组可用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记。
技术介绍
铁皮石斛作为药用石斛最主要的代表种，是我国最珍贵的传统名贵中药材之一，被尊列为“中华九大仙草”之首，素有“药中黄金”之美称。早在东汉末年的《神农本草经》中就有记载，《本草纲目》和《中药大词典》等我国古代多部医学著作中都记载了铁皮石斛具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等作用，对咽喉疾病、肠胃疾病、白内障、心血管疾病、糖尿病、肿瘤均具有显著疗效，特别是对人体肺癌细胞具有高达74.7~97.2 %的抑制率。铁皮石斛通常分为软脚和硬脚两大类:软脚铁皮石斛茎大多粗短且柔软，石斛多糖和石斛碱含量高，味甘，咀嚼后几乎没有残渣。经过边炒边扭的工艺加工炮制成螺旋形的石斛干品就是上等的“铁皮枫斗”。一般来说，至少10公斤生鲜的软脚铁皮石斛才能加工成I公斤铁皮枫斗。而正宗的野生铁皮石斛通常在每公斤1000元左右，这导致铁皮枫斗的价格堪比黄金。硬脚铁皮石斛茎较长且质硬，黏性小(石斛多糖含量低)，不能被烘软，只能煮水服用。另一方面，野生铁皮石斛生境独特，繁殖困难，加上过度采收，历史文献报道的浙江、云南、贵州、广西、湖南、安徽、江西等铁皮石斛主要分布区，目前的实地调查中已经很难找到大面积的野生铁皮石斛分布。2011年铁皮石斛成为第二批“国家重点一级保护的珍稀濒危植物”，根本不可能用于生产，所以近10年来，铁皮石斛人工栽培、规模化种植技术的研究成为热点之一。目前，铁皮石斛的人工栽培技术逐渐成熟，产业化规模不断扩大。形成了集科研、种植、加工、销售为一体的铁皮石斛产业群。然而，生鲜的软脚和硬脚铁皮石斛因为形状、色泽方面的差别，消费者容易分辨。不过，经过烘焙、卷曲等工序而成的铁皮枫斗，其原料究竟是软脚还是硬脚，单凭肉眼观察，就算是行家已很难分辨，更不要说普通消费者了。而且硬脚铁皮石斛由于纤维含量高，不易折断，更容易做出枫斗，所以市场上往往被用来以次充好，冒充或掺入软脚铁皮枫斗中。加上现有的植物分类学或化学手段，很难鉴定到物种水平，所以多年来一直没有对软脚和硬脚铁皮石斛的高效、科学、通用的鉴定方法。分子标记鉴定是当今流行的比传统鉴定方法更科学和灵敏的重要方法之一。其中的微卫星标记(SSR, Simple Sequence Repeat)作为以DNA聚合酶链式反应(PCR, Polymerase Chain Reaction)技术和测序技术为基础的分子标记,被认为是当前种内遗传变异研究中分辨率最高、揭示力最强的分子标记之一。迄今，国内外尚无通过铁皮石斛微卫星分子标记开发来进行硬脚和软脚铁皮石斛品种鉴定的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一组铁皮石斛的微卫星分子标记，其能用于准确区分硬脚和软脚铁皮石斛，为市场打假和药材鉴定所用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一组共7个铁皮石斛微卫星分子标记，他们的引物对序列分别为:HZsOl 引物对:上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’ ；下游5’ -GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3’ ；HZs02 引物对:上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG-3’ ；下游5，-TTTTGGCAATGAACCTAATG-3，；HZs03 引物对:上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3 ’ ；下游5，-CTCCTTCCCAATGAGCTT-3，；HZs04 引物对:上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3 ’ ；下游5，-CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3，；HZs05 引物对:上游 5’ -GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3 ’ ；下游5 ’ -TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3，；HZs06 引物对:上游 5’ -TGGGCTAACCATTGATTTAC-3 ’ ；下游5，-CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT-3，；HZs07 引物对:上游 5’ -CAAATTCTCCGATCTCCGTT-3 ’ ；[0021 ]下游 5 ’ -AAGTCCCCAAACCTTATCAA-3，。作为本专利技术的铁皮石斛微卫星分子标记的另一个核心内容，他们的引物对的PCR退火温度分别为:HZsOl:58°C ；HZs02:55°C ；HZs03:55°C ；HZs04:55°C ；HZs05:50°C ；HZs06:53 °C ；HZs07:56°C。本专利技术的另一个目的是上述铁皮石斛微卫星分子标记可用于对硬脚和软脚铁皮石斛进行鉴定，HZsO 1、HZs02、HZs03、HZs04为硬脚铁皮石斛特有序列，HZs05、HZs06、HZs07为软脚铁皮石斛特有序列。本专利技术是在生物信息学方法基础上，利用金钗石斛EST序列，筛选微卫星分子标记，并进一步用于寻找铁皮石斛微卫星分子标记，选出在不同时间、地点和操作人员条件下，都可获得的4个稳定有效的硬脚铁皮石斛特有微卫星分子标记和3个稳定有效的软脚铁皮石斛特有微卫星分子标记。本专利技术是通过这样的技术方案来实现的:步骤(1).金钗石斛EST序列的获得:构建金钗石斛花的EST文库，完成测序和拼接工作，得到金钗石斛EST序列；步骤(2).含有微卫星EST序列的筛选:用计算机微卫星分析程序和在线微卫星位点分析软件，对所测序的金钗石斛EST序列进行筛选，获得含有微卫星位点的金钗石斛EST序列；步骤(3).引物设计:在含有微卫星位点的金钗石斛EST序列上，用引物设计软件设计扩增含有微卫星位点的DNA聚合酶链式反应引物，该引物含有的碱基数控制在18~22个，两引物退火温度差<4°C，扩增的DNA片段在350个碱基以内；步骤(4).微卫星验证:利用上述步骤(3)设计的引物对铁皮石斛基因组DNA进行聚合酶链式反应扩增、扩增产物的电泳分离、银染检测、微卫星位点的再扩增、亚克隆和测序确认工作。通过上述四步骤，最终筛选出的4个硬脚铁皮石斛特有微卫星标记引物的核苷酸序列(5’ -3’)如下:HZsOl 引物对:上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’ ；下游5'-GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3'；HZs02 引物对:上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG-3 ’ ；下游5'-TTTTGGCAATGAACCTAATG-3'；HZs03 引物对:上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3 ’ ；下游5'-CTCCTTCCCAATGAGCTT-3'；HZs04 引物对:上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3 ’ ；下游5'-CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3'；3个软脚铁皮石斛特有微卫星标记引物的核苷酸序列(5’ -3’ )如下:HZs05 引物对:上游 5'-GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3'；下游5'-TAAACCTTATAGAAGCCAAA-3'；HZs06 引物对:上游 5’ -TGGGCTAACCATTGATTTAC-3 ’ ；下游5'-CAGACTTTATTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记，其特征在于该微卫星分子标记包括HZs01、HZs02、HZs03、HZs04、HZs05、HZs06、HZs07，这些微卫星标记引物的核苷酸序列（5’?3’）如下：HZs01引物对：上游5’?CGAAGGTGGCGAAACAAGAC?3’，如SEQ?ID?NO.1所示；??????下游5’?GAAAACTACAAATTACCAAAGAC?3’，如SEQ?ID?NO.2所示；HZs02引物对：上游5’?AAGTGGATAACGGGGATAAG????3’，如SEQ?ID?NO.3所示；????下游5’?TTTTGGCAATGAACCTAATG?3’，如SEQ?ID?NO.4所示；HZs03引物对：上游5’?GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC?3’，如SEQ?ID?NO.5所示；??????下游5’?CTCCTTCCCAATGAGCTT?3’，如SEQ?ID?NO.6所示；HZs04引物对：上游5’?GAGAGAAGGGGAGCAATG?3’，如SEQ?ID?NO.7所示；?????下游5’?CTAAGTTCGCACTCATCTCTG?3’，如SEQ?ID?NO.8所示；HZs05引物对：上游5’?GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC?3’，如SEQ?ID?NO.9所示；????下游5’?TAAACCTTATAGAAGCCAAA?3’，如SEQ?ID?NO.10所示；??HZs06引物对：上游5’?TGGGCTAACCATTGATTTAC?3’，如SEQ?ID?NO.11所示；?????下游5’?CAGACTTTATTGTTTGCCTAATT?3’，如SEQ?ID?NO.12所示；?HZs07引物对：上游5’?CAAATTCTCCGATCTCCGTT?3’，如SEQ?ID?NO.13所示；?下游5’?AAGTCCCCAAACCTTATCAA?3’，如SEQ?ID?NO.14所示。...

【技术特征摘要】
1.一组用于鉴定硬脚和软脚铁皮石斛的微卫星分子标记，其特征在于该微卫星分子标记包括HZsO 1、HZs02、HZs03、HZs04、HZs05、HZs06、HZs07，这些微卫星标记引物的核苷酸序列(5’ -3’)如下: HZsOl引物对: 上游 5’ -CGAAGGTGGCGAAACAAGAC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示；下游 5’ -GAAAACTACAAATTACCAAAGAC-3’，如 SEQ ID N0.2 所示； HZs02引物对: 上游 5’ -AAGTGGATAACGGGGATAAG _3’，如 SEQ ID N0.3 所示；下游 5’ -TTTTGGCAATGAACCTAATG-3’，如 SEQ ID N0.4 所示； HZs03引物对: 上游 5’ -GCAAAAGCTAGGGTAGAGTTC-3’，如 SEQ ID N0.5 所示；下游 5’ -CTCCTTCCCAATGAGCTT-3，，如 SEQ ID N0.6 所示； HZs04引物对: 上游 5’ -GAGAGAAGGGGAGCAATG-3’，如 SEQ ID N0.7 所示；下游 5’ -CTAAGTTCGCACTCATCTCTG-3’，如 SEQ ID N0.8 所示； HZs05引物对: 上游 5’ -GGAGGAAGTAGGGAGTCAAC-3’，如 SEQ ID N0.9 所示；下游 5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧中，卢江杰，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：