本发明专利技术公开芥末成分环介导等温扩增（LAMP）引物、试剂盒及检测方法，其碱基序列如SEQ?ID?NO.19～24；采用LAMP检测技术，建立了适用于食品中芥末致敏原特异性检测的方法，本发明专利技术所述方法操作简单，不依赖昂贵仪器，检测时间在1小时左右，方法灵敏度达到0.5%，检测效率达到传统PCR方法或荧光定量PCR方法，能够应用于检验检疫实际工作，尤其适用于大量样品快速初筛和各种基层实验室食品品质监控，适合作为行业推荐性标准应用推广。
【技术实现步骤摘要】
芥末成分的环介导等温扩增引物、试剂盒及其应用
本专利技术属于食品检验技术方法领域，具体涉及一种芥末成分环介导等温扩增(LAMP)引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障碍。它是一种复发率很高的疾病，引起变态反应的抗原被称为变应原，又名致敏原。食品成分中存在的天然致敏原成分会引起6%至8%的儿童和2%的成人的过敏反应，严重的会危及生命。预包装食品由于多是成分复杂的深加工产品，如果含有致敏原成分而又未能明确告之，就有可能引起过敏，危害消费者的健康安全。目前大约有160多种食品致敏原，芥末为常见的致敏原之一。2003年以来，欧盟、美国、香港等发达国家和地区相继制定了预包装食品致敏原标识要求的法规，并已于2005年起陆续发布和实施，对我国食品出口贸易造成了明显影响。由于目前我国在食品致敏原成分检测方法领域技术薄弱，随着越来越多国家和地区对食品致敏原成分标识法规的全面实施，食品标签的致敏原成分标识要求和符合性检验将会成为我国食品出口贸易的重要障碍。芥(mustard)是十字花科(Cruciferae)数种草本植物的统称,或指其辣味种子所制成的调味品。主要品种是:白芥(Sinapis alba，或黄芥)，原产于地中海地区；棕芥(Brassica juncea,或芥菜),原产于喜马拉雅山区。目前，致敏原成分检测方法主要有酶联免疫法、聚合酶链式反应法、色谱质谱法、表面等离子共振免疫法等。但是不同的方法的检测限存在较大的区别，因此机构之间、国家之间应该采用一种检测结果较为精确、重复性较好的标准方法。目前较多国家所认可的方法是酶联免疫法。但是酶联免疫法也受许多因素制约，如被测食品母体、检测人员、试剂盒坐`寸o随着分子生物学理论和技术的快速发展，以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础的新型鉴定技术已日益得到广泛应用。环介导等温扩增法(LAMP, Loop-mediated IsothermalAmplification)是在PCR基础上创建的一种较理想的手段，LAMP引物包括两个外引物和两个内引物，特异结合靶序列上的6个特异区域。内引物FIP包含Flc (与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含Blc (与BI区域互补)和B2序列，外引物为F3和/或B3序列，本专利技术在内外引物的基础上引入环引物BLP，大大缩短了反应时间，具体LAMP的引物组成及对应区域信息见图1。其特点是:①只需一恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性:采用六个区段，四条引物，扩增特异性高，可以根据是否扩增来判断目标基因的存在与否；③快速、高效扩增:扩增在不到Ih即可完成，且产率高；④灵敏度高:扩增模板可达10拷贝或更少；⑤鉴定简便:在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，可用肉眼观察判断扩增与否；另外，它利用恒温和低反应温度(63°C )，减少细胞损伤，检测人员实际操作非常简便。总体而言，LAMP法是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要特殊的试剂和仪器设备，采用该方法能建立起总成本低廉的检测体系，在转基因食品检测、致敏原成份检测等领域具有广阔的应用前景。本项目拟在前期研究的基础上，将LAMP检测技术应用于食品中过敏原成分芥末的检测，针对芥末反转录酶RT基因，应用六条特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简单，既能节省时间，又可大大降低检测成本，适用于基层实验室，可作为传统PCR方法的有益补充。
技术实现思路
本专利技术的技术方案为:通过考察并锁定芥末成分靶基因，然后设计合成4套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.1~24 ;，优化体系，最后确定一套特异性LAMP引物，其碱基序列如SEQ ID N0.19~24 ;进而确定了 LAMP方法的技术参数，最后验证引物特异性、灵敏度、稳定性。本专利技术的具体技术方案如下:本专利技术涉及一种检测芥末成分的环介导等温扩增引物，其碱基序列为SEQ ID N0.19~24，如下:F3:cggcctttac taggaggt (SEQ ID N0.19)B3:ttcgagaatc gagcaacg (SEQ ID N0.20)FIP(Flc+F2):tcgacttagg catccttacg gattgagccg agggtcataa (SEQ IDN0.21)BIP(Blc+B2):agataatatt ggccgagcac ccgtaataga actcacgatc cagg (SEQID N0.22)FLP:ccagtattcg gactctcgg (SEQ ID N0.23)BLP:aatacccttg ctacgtcaat gt (SEQ ID N0.24)本专利技术的另一方面涉及一种芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其中，检测试剂盒包括检测引物:SE Q ID N0.19~24。优选的情况下:对于上述芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒中，每25ul反应体系中包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6yM，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2 y M，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 ii M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04, IOmM(NH4)2SO4,0.l%Tween20,IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y I SYT0-9。上述试剂盒在使用过程中，除了按上述反应体系加入上述试剂之外，还需要加入模板DNA和蒸馏水(补足25 ii L反应体系)，再进行LAMP扩增反应。本专利技术的另一方面在于，公开一种利用上述芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，来检测芥末成分的方法，其方法步骤包括:①提取待测样品的基因组DNA ;②以步骤①提取的DNA作为模板，利用环介导等温扩增法检测:每25 ii L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20 各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8 y M，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y ISYTO-9, 2 ill DNA模板、蒸馏水:余量；反应条件为:保温阶段为63°C 30s, I个循环；循环阶段为63°C 15s，63°C 45s，45个循环。③检测结果以扩增曲线进行判断。本专利技术的另一方面在于，公开一种利用上述的环介导等温扩增引物在检测芥末成分方面的应用。本专利技术的创新特征是:本专利技术将LAMP检测技术应用于对芥末内源特异基因检测，针对芥末内源特异基因，应用特异引物在恒温的条件下、简易的设备中，仅用一小时左右有效的完成筛查任务，结果判断简本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测芥末成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ?ID?NO.19～24。
【技术特征摘要】
1.一种检测芥末成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，碱基序列为SEQ IDN0.19 ~24。2.一种芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物:SEQ IDN0.19 ~24。3.根据权利要求2所述的芥末成分的环介导等温扩增法检测试剂盒，其特征在于，在检测试剂盒中:每 25 ii L 的 LAMP 反应体系包括:SEQ ID NO:21 ~22 各 1.6 y M，SEQ ID NO:19 ~20各 0.2iiM，SEQ ID NO:23 ~24 各 0.8iiM，20mM pH8.8 的 Tris-HCl，IOmM KCl,6mM MgS04,10mM(NH4)2S04,0.l%Tween20，IM 甜菜碱，1.6mM dNTP，8U Bst 大片断 DNA 聚合酶，0.5 y ISYT0-9,2u I DNA 模板。4.利用权利要求2所述试剂盒检测芥末成分的...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹际娟，徐君怡，孙铭英，曹冬梅，
申请(专利权)人：曹际娟，徐君怡，孙铭英，曹冬梅，
类型：发明
国别省市：
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