一种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法，具体地，本发明专利技术方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对。本发明专利技术方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、避免假阳性、快速（常规50分钟完成检测）地对含有VPRNA的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
—种副溶血弧菌VP核酸恒温扩增方法
本专利技术涉及食源致病性微生物的生物检测
，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的副溶血弧菌(VP)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,该菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。在多种食物如水产品、腌制品中常会发生副溶血性弧菌污染。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，均己超过沙门氏菌食物中毒，跃居首位。目前副溶血弧菌检测方法主要有分离培养方法及分子生物学方法。分离培养法操作步骤繁琐，检测周期长，一般需要5~7天完成，不能满足快速检测的要求。分子生物学方法有PCR方法和LAMP方法。PCR方法具有特异性强、灵敏度高等特点，但这类方法通常检测成本高，需要比较昂贵的PCR仪，对实验环境和操作者技术要求也比较高。LAMP方法不需要昂贵仪器，操作也简便。但以上两种方法检测靶标均为DNA，不能区分活菌与死菌，容易发生假阳性结果。实时突光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplification and Testing,简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C)，无需热循环。SAT技术直接以病原微生物特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，在自然界中病原微生物死亡后靶`标RNA会快速降解，而DNA会存在一段时间，通过对目标RNA的检测，可实现食品致病菌活菌检测，降低假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，避免假阳性，设备简单，成本低的VP RNA检测方法。本专利技术的第一方面，提供了一种副溶血弧菌VP的扩增方法，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和Τ7 RNA聚合酶。在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的捕获探针。在另一优选例中，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。在另一优选例中，所述的检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记DABCYL淬灭基团。在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。在另一优选例中，所述的捕获探针可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。在另一优选例中，所述方法还包括:在另一阳性(对照)反应体系或阴性(对照)反应体系中进行扩增反应。在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、VP内标(VP ICRNA)、所述捕获探针和所述检测探针。在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。在另一优选例中，所述的检测探针用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。在另一优选例中，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的副溶血弧菌或衍生自所述副溶血弧菌核酸。在另一优选例中，所述的待测核酸是来自各类鲜冻水产品及腌制食品。本专利技术的第二方面，提供了一种副溶血弧菌VP的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括: 用如本专利技术第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。在另一优选例中，所述对照组包括:VP阳性对照组、VP阴性对照组、VP内标对照组。本专利技术的第三方面，提供了一种副溶血弧菌VP的检测试剂盒，所述试剂盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增副 溶血弧菌的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示; 以及使用说明书。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种组分: (b)捕获探针； (C)检测探针； (d)EV内标序列；和/或 (e)内标检测探针。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和EV检测探针存在于一检测液中。在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于VP检测液中。在另一优选例中，所述VP内标为竞争性内标，并与VP靶标核苷酸(VP RNA)使用同一对引物(Τ7和ηΤ7)。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括VP阳性对照和/或VP阴性对照。在另一优选例中，所述捕获探针是与副溶血弧菌的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合的捕获探针；和/或 所述检测探针是与根据所述VP靶标核酸(VP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的VP检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与副溶血弧菌VP的靶标核酸(VP RNA)序列特异结合。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征: 所述检测探针包括如SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列；和/或 所述的捕获探针包括如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列；和/或 所述的VP内标序列包括如SEQ ID NO: 7所示的核苷酸序列；和/或 所述的内标检测探针包括如S EQ ID NO: 6所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分:裂解液、核酸提取液、洗涤液、VP反应液、VP检测液、SAT酶液、VP阳性对照、VP阴性对照和VP内标； 其中， 所述裂解液包括硫酸铵((NH4)2SO4)和HEPES ； 所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠； 所述洗涤液包括NaCl和SDS ； 所述VP反应液包括dNTP和NTP ； 所述VP检测液包括T7引物、nT7引物、EV检测探针和内标检测探针； 所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、Τ7 RNA聚合酶； 所述VP阳性对照包括副溶血弧菌5’端的toxR基因的体外转录RNA稀释物； 所述的VP阴性对照是不含有副溶血弧菌靶标核酸(VP RNA)序列或不含有副溶血弧菌的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水； VP内标:含VP内标RNA(VP IC RNA,序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示)稀释物。在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中， A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种副溶血弧菌VP的方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括：T7引物：序列如SEQ?ID?NO:?3所示；和nT7引物：序列如SEQ?ID?NO:?4所示。

【技术特征摘要】
2012.08.07 CN 201210280579.21.一种副溶血弧菌VP的方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤:在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增副溶血弧菌VP的特异性引物对，所述引物对包括: T7引物:序列如SEQ ID NO: 3所示；和 nT7引物:序列如SEQ ID NO: 4所示。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的捕获探针。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括副溶血弧菌VP的检测探针。4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤:在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。5.一种副溶血弧菌VP的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括: 用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和 在扩增反应过程之中或之后，检测副溶血弧菌VP的特异性探针发出的荧光信号。6.一种副溶血弧菌VP的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: (a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增副溶血弧菌的特异性引物对，所述引...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长明，于明辉，尹华立，朱凤，居金良，
申请(专利权)人：上海仁度生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：