本发明专利技术涉及BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。建立了一种遗传稳定、表型稳定的角膜营养不良模型，它通过将非人哺乳动物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His而实现。以本发明专利技术的转基因动物为研究模型，可在基因水平探讨防治角膜营养不良疾病的可行性，为开展颗粒状角膜营养不良的基因诊断及治疗提供了研究基础。
【技术实现步骤摘要】
BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。
技术介绍
角膜营养不良(Corneal Dystrophy)是一组与基因遗传相关的原发性、进行性、致盲性角膜病变，是角膜遗传疾病中常见的类型，迄今为止，穿透性角膜移植术仍是治疗这种疾病的主要手段。但研究表明，穿透性角膜移植手术后仍会有角膜营养不良病情的复发和恶化(Yoo SY, Kim T, Lee SY, et al.A simple DNA chip for diagnosis of mostcommon corneal dystrophies caused by beta igh3gene mutations.Proceedings of thefrontiers in the convergence of Bioscience and Information Technologies，2007，69-74)o目前已确定的与角膜营养不良相关的染色体有:1、5、9、10、12、16、17、20、21以及X 染色体。致病基因主要有 BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S1、GSN 等(Klintworth GK.Advancesin the molecular genetics of corneal dystrophies.Am J Ophthalmol,1999,128 (6): 747-754)。角膜营养不良大多为常染色体显性遗传，少数为常染色体隐性遗传或X染色体连锁遗传。研究表明多种类型的角膜营养不良都与BIGH3 (TGFBI)基因的突变有关，因此通常这些由BIGH3基因突变所产生的角膜营养不良被称为BIGH3基因相关性角膜营养不良。BIGH3基因又被称为TGFBI基因，定位于5q31 (人类5号染色体长臂3区I带)，基因跨度 30kb (Skonier J, Bennett K, Rothwell V, et al.Beta~igh3: a transforming growthfactor-beta responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cellattachment invitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice[J].DNACell Biol 1994，13(6):571-584)。目前已经发现BIGH3基因存在多个突变且与疾病发生相关，对BIGH3基因的多个突变点都有研究。但是，对于BIGH3基因突变仅停留在各突变位点产生的表型性状观察，而对于BIGH3基因突变导致的角膜营养不良的发病机制研究主要集中在研究其基因突变位点的检测，至今未见文献报道关于BIGH3基因突变是否能够成功建立疾病动物模型，以及是否可以获得稳定传代的疾病动物模型。由于在人类先天性眼病的研究中存在着许多限制性因素，对于人类的先天性角膜疾病的发生机制及致病基因的克隆等研究难度较大，成功建立疾病动物模型将会对其发病机制的研究带来很大的帮助。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供BIGH3在制备角膜营养不良动物模型中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种制备角膜营养不良动物模型的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种制备转基因非人哺乳动物的方法，所述方法包括:(I)提供一表达构建物，该表达构建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His ；(2)将(I)的表达构建物注射入非人哺乳动物受精卵细胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管中，使其受孕生产，获得转基因非人哺乳动物。在一个优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。在另一优选例中，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因。在另一优选例中，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:终止子。在另一优选例中，所述的人突变型Bigh3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的方法获得的转基因非人哺乳动物的用途，用于作为角膜营养不良的动物模型；或用于筛选预防和/或治疗角膜营养不良的药物。在一个优选例中，所述的角膜营养不良是颗粒状角膜营养不良。在本专利技术的另一方面，提供一种表达构建物，该表达构建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His。在另一优选例中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因和/或终止子。在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。在本专利技术的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于制备角膜营养不良的转基因非人哺乳动物。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。【附图说明】图1、PGK-BIGH3 (M) -1RES-EGFP 重组表达质粒示意图。图2、pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP质粒线性化及电泳图；其中，泳道1:质粒 DNA of pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP ；泳道2:质粒DNA of pPGK_Bigh3 (M) -1RES-EGFP经XbaI酶切线性化用于显微注射的片段；泳道MW:MBI GeneRuler Ikb DNA Ladder (晶美生物，Cat#SM0311)。图3、RT-PCR鉴定转基因阳性F。代小鼠的情况，以人BIGH3基因阳性作为转基因阳性的标志。图4、野生型小鼠的透明角膜。图5、M53小鼠Fl代小鼠呈现出混浊的角膜。图6、野生型小鼠的角膜的OCT图像。图7、M53小鼠Fl代小鼠角膜的OCT图像。【具体实施方式】本专利技术人经过深入而广泛的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的角膜营养不良模型，它通过将非人哺乳动物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His而实现。以本专利技术的转基因动物为研究模型，可在基因水平探讨防治角膜营养不良疾病的可行性，为开展颗粒状角膜营养不良的基因诊断及治疗提供了研究基础。在此基础上完成了本专利技术。本专利技术中，所述的非人哺乳动物可以选自:小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴等；所述的非人哺乳动物在基因组的组成、个体的发育、代谢方式、器官解剖、疾病发病机制等方面和人类接近。优选的，所述的非人哺乳动物是鼠；更优选的是小鼠。如本文所用，所述的“角膜营养不良”为一系列与家族遗传有关的原发性进行性角膜病变的总称。该病多数为常染色体显性遗性；原发于角膜。如本文所用，所述的“颗粒状角膜营养不良”是角膜营养不良的一种，表现为角膜中央前弹力层下可见灰白色状混浊，合并成大小不等、界限清楚的圆形或不规则团块，形态各异，逐步向角膜实质深层发展，晚期混浊块之间出现弥漫性混浊，严重影响视力。如本文所用，所述的“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提供一表达构建物，该表达构建物由5’→3’依次包含以下操作性连接的元件：PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His；(2)将(1)的表达构建物注射入非人哺乳动物受精卵细胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管中，使其受孕生产，获得转基因非人哺乳动物。
【技术特征摘要】
1.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供一表达构建物，该表达构建物由5’一3’依次包含以下操作性连接的元件:PGK启动子，人突变型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突变型Bigh3基因编码的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突变为His ； (2)将(I)的表达构建物注射入非人哺乳动物受精卵细胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管中，使其受孕生产，获得转基因非人哺乳动物。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:EGFP基因。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在IRES基因的3’端，还包括:终止子。5.如权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王方，廖昕，崔红平，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：
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