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一种重组腺病毒及其制备和应用制造技术

技术编号:9662389 阅读:139 留言:0更新日期:2014-02-13 15:20
本发明专利技术提供一种重组腺病毒及其制备和应用,该重组腺病毒同时包含免疫调节因子IL-10和变应原基因,二者融合表达,可作为口服疫苗,用于预防和治疗蛋白质变应原所致的过敏性疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种重组腺病毒及其制备和应用
本专利技术涉及分子生物学领域,具体地涉及一种重组腺病毒,特别涉及共同表达IL-10与过敏原基因的重组腺病毒及其制备和应用。
技术介绍
过敏性疾病如变应性鼻炎、过敏性哮喘、食物药物过敏等是困扰人们生活工作的常见健康问题,过敏性休克更是威胁生命的杀手。世界过敏组织(WAO)在世界首个过敏性疾病日公布了对30个国家进行的过敏性疾病流行病学调查结果:在这些国家的总人口中,22%患有IgE介导的过敏性疾病,包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和过敏性休克等。据世界卫生组织(WHO)估计,全球约I亿5千万人患有哮喘,其中50%以上的成人及至少80%的儿童患者由过敏因素诱发,每年有18万余人死于哮喘。我国目前尚缺乏全国性的过敏性疾病的流行病学资料,但从各地区已报道的情况看,过敏性哮喘、过敏性鼻炎以及食物过敏等的发病率及患病率是明显上升的,过敏性疾病正在成为新世纪的流行病。过敏性疾病的发生,主要是由于在遗传因素和环境因素的共同作用下,特应质个体的免疫系统对外来的无害抗原发生了反应,从而引起相应的临床症状,包括:过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、荨麻疹,以及表现为多个系统受累的严重过敏反应等。引起特异性过敏反应的物质,称为过敏 原。尘螨、霉菌、花粉、食物、动物皮屑或分泌物、昆虫、橡胶等是较为常见的过敏原来源,其中引起过敏反应的成分,多数为蛋白质。目前对于过敏性疾病的预防,除了被动地避免接触过敏原,尚缺乏非常有效的主动干预措施。抗组胺药、白三烯受体拮抗剂及糖皮质激素等在治疗上均只能暂时抑制炎症介质及炎症细胞以控制过敏症状。针对过敏原的特异性免疫治疗(specificimmunotherapy,简称SIT)是目前唯一针对病因的长期有效的治疗手段。自1911年Noon等首次发表利用花粉过敏原提取液皮下注射进行脱敏治疗的研究,迄今SIT已有100余年历史。常规SIT方案为:在3-5年的治疗周期内,每周2次,由低浓度到高浓度向机体注射过敏原,达到治疗剂量后,维持该剂量持续治疗,直至达到理想效果;SIT目的是要逐步诱导机体免疫系统产生对特异过敏原的耐受,其核心步骤是诱导外周T细胞耐受的状态,而外周T细胞耐受的建立以过敏原特异的调节性T细胞(Treg细胞)产生为特征。尽管目前SIT是唯一的针对过敏性疾病病因的治疗方法,但却存在如下不足:1)疗程长:通常在开始治疗后半年到I年左右时间开始起效,而总疗程需要3-5年,才可以达到比较理想的治疗效果;2)每周一到两次的注射,总共需要注射上百次;3)存在一定风险:治疗过程中可能会诱发严重反应;4)给药不便:传统的SIT为皮下注射,每次均需到医疗机构进行注射;5)目前用于SIT的过敏原主要来自于天然提取物,这些提取物由多种致敏和不致敏的化合物共同组成,成分复杂,难以标准化,且提取过程有引入新的致敏物质的风险。以舌下含服替代皮下注射的免疫治疗方法,给药方便,安全性及依从性较好,但其临床效果存在很大争议,2005年伯明翰大学医院Wilson等人总结分析了已发表的64个采用舌下免疫治疗的临床研究的结果,发现其有效性只有皮下注射的一半左右,而且疗程和给药频率与皮下注射相比并未减少。近来,一种显著减少给药次数的短疗程方法受到关注,那就是淋巴结内直接注射过敏原。该方法在动物实验中取得了满意的效果,一项165名过敏原患者参与的临床试验也表明,两月内进行三次腹股沟淋巴结内过敏原注射,在减轻临床症状方面的效果与三年的标准SIT相当;然而对超声定位仪器、相关专业人员的依赖以及穿刺本身的风险性,使其仍然不能成为理想的免疫治疗手段。
技术实现思路
鉴于上述不足,本专利技术人提出了一种重组腺病毒:将IL-10基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体,形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型重组腺病毒。以该重组腺病毒为主要成分的口服过敏原疫苗通过一次给药,能有效的预防和治疗蛋白质过敏原所致的过敏。依据本专利技术的第一方面,提供一种重组腺病毒,其将IL-10基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体,形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型重组腺病毒。本专利技术的重组腺病毒中的过敏原基因为具有致敏活性的蛋白质过敏原基因,且所述过敏原在宿主细胞中作为重组蛋白质表达。本专利技术涉及的过敏原包括在http://www.allergen, org/下可获得的所有主要蛋白质过敏原。根据本专利技术,优选的过敏原包括鸡蛋过敏原卵清蛋白(Ovalbumin,简称0VA),户尘螨过敏原Der pi,粉尘螨过敏原Der fl,桦树花粉过敏Bet vI,蒿属花粉过敏原Art vl和Art v3等。优选地,所涉及的蛋白质过敏原为卵清蛋白(Ovalbumin,简称OVA)。更为优选地,IL - 10与蛋白质过敏原OVA基因进行融合表达,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。依据本专利技术的第二方面,提供一种重组腺病毒的制备方法:采用腺病毒载体系统,将IL-10基因及过敏原OVA基因分别克隆入同一腺病毒穿梭质粒的多克隆区,构建同时表达IL-10和OVA的重组穿梭质粒,将该重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化宿主细胞,经同源重组生成重组腺病毒质粒,再经包装细胞包装获得具有感染活力的腺病毒颗粒,并在包装细胞中进行扩增,收集并裂解包装细胞后,纯化得到重组腺病毒。优选地,采用AdEasy腺病毒系统,将人IL-10基因及过敏原OVA基因依次分别克隆入同一穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆区,构建重组穿梭质粒pAdTrack-1L-10-0VA,将该重组穿梭质粒经限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒pAdEasy-Ι共转化大肠杆菌BJ5183,经同源重组生成重组腺病毒质粒,经限制性内切酶Pac I酶切,酶切产物纯化后借助脂质体转染包装细胞系293细胞,包装获得具有感染活力的重组腺病毒颗粒。将初次包装所获得的原代腺病毒颗粒,继续感染293细胞,进行病毒扩增,待293细胞完全病变后,将其收获裂解,纯化得到重组腺病毒。更优选的,收获裂解的293细胞经氯化铯(CsCl)梯度离心纯化浓缩得到滴度在IO10Pfu/毫升左右的重组腺病毒。依据本专利技术的第三方面,提供一种疫苗,其主要成分为上述重组腺病毒。依据本专利技术的第四方面,提供一种组合物,其主要成分为上述的重组腺病毒。依据本专利技术的第五方面,提供一种上述疫苗或组合物在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。优选地,所述过敏性疾病为尘螨、霉菌、花粉、动物皮毛、昆虫、食物等的过敏原所致的过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、荨麻疹、特应性皮炎、荨麻疹或严重过敏反应坐寸ο本专利技术的提供的重组腺病毒疫苗不仅可用于只对一种过敏原具有过敏反应的患者。依据本专利技术提供的方法生产的表达不同过敏原的重组腺病毒疫苗,可以组合使用,尤其适用于同时对多种蛋白类物质过敏的患者。本专利技术首次在同一载体上同时表达免疫耐受诱导因子和过敏原基因用于预防和治疗过敏性疾病。实验证明本专利技术的重组腺病毒疫苗(优选口服)对于预防和治疗过敏性疾病有明显的效果。本专利技术为过敏性疾病的预防和治疗提供了一种方便、安全、有效的新方法,具有良好的应用前景。本专利技术的优势在于:1、疫苗安全性:以复制缺陷型重组腺病毒为载体疫苗,病毒不会复制,不会整合到基因组,不本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种重组腺病毒,其特征在于:将IL?10基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体,形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型腺病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种重组腺病毒,其特征在于:将IL-1O基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体,形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型腺病毒载体。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于:所述过敏原基因为具有致敏活性的蛋白质过敏原基因,且所述过敏原基因在宿主细胞中作为重组蛋白质表达。3.根据权利要求1所述的重组腺病毒,其特征在于:过敏原基因为卵清蛋白(OVA)基因。4.根据权利要求1-3所述的重组腺病毒,其特征在于:IL-10基因与过敏原OVA基因进行融合表达,融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。5.权利要求1-3任一项所述重组腺病毒的制备方法:米用腺病毒载体系统,将IL-10基因及过敏原OVA基因分别克隆入同一腺病毒穿梭质粒的多克隆区,构建同时表达IL-10和OVA的重组穿梭质粒,将该重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化宿主细胞,经同源重组生成重组腺病毒质粒,再经包装细胞包装获得具有感染活力的腺病毒颗粒,并在包装细胞中进行扩增,收集并裂解包装细胞后,纯化得到重组腺病毒载体。6.权利要求5所述重组腺病毒的制备方法:采用AdEasy腺病毒系统,将人IL-10基因及过敏原...

【专利技术属性】
技术研发人员:马仕坤赵婧文
申请(专利权)人:马仕坤
类型:发明
国别省市:

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