3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用。本发明专利技术涉及氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本发明专利技术提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。所述3-吡唑基酪氨酸翻译系统包含：(i)3-吡唑基酪氨酸；(ii)正交氨酰基-tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。
【技术实现步骤摘要】
3-吡唑基酪氨酸翻译系统及其应用
本专利技术属于生物化学领域。具体地，本专利技术提供氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。本专利技术还涉及一种3-吡唑基酪氨酸((S)-2-氨基-3-(4-羟基-3-(1H-吡唑-1-基)苯基)丙酸，简写为pyTyr)的高效合成方法及包含其的翻译系统。更具体地，本专利技术涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将3-吡唑基酪氨酸定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本专利技术还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质，例如，含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体，以及含有3-吡唑基酪氨酸的绿色荧光蛋白突变体的应用。
技术介绍
电子传递(Eletctron Transfer, ET)涉及体内许多重要的生化过程,包括光合作用和细胞色素P450介导的氧化作用等。尽管目前人们在了解生物大分子如核酸及蛋白质的电子传递机制方面取得了巨大进步，但是对蛋白质的电子传递实验仍依赖于在蛋白质本身含有的残基如组氨酸或半胱氨酸上连接探针来进行，因此该方法仅能用于研究小的可溶性蛋白，这也就大大地限制了其应用。光诱导电子传递(photo-1nduced electrontransfer,PET)导致的突光淬灭是一种用来探索生物大分子中的电子传递机理及酶分子构象动力学等的有利工具，但由于受到目前技术的限制，缺乏新技术手段仍是将光电子转移应用于生物功能研究中的一个瓶颈。研究者通常利用色氨酸和酪氨酸等天然氨基酸作为电子供体，荧光基团作为电子受体，因此也只能限制于研究相对简单的生物学系统。我们通过在蛋白中遗传整合金属螯合非天然氨基酸(UAAs)来克服上述限制因素。相比于在蛋白电子传递过程研究中作为电子供体的多种天然氨基酸以及多巴、3-氨基酪氨酸或者二氟代酪氨酸等非天然氨基酸，3-吡唑基酪氨酸-Cu (II)可以作为电子受体，这种独特的性质使得我们可以研究复杂生物学系统中的电子传递过程，而这是先前的电子传递研究方法所不能达到的。尽管已有报道含有可以结合金属基团(如联吡啶，羟基喹啉等)的非天然氨基酸可以被基因编码至目标蛋白中，但是对于它们在蛋白中发挥电子传递功能的应用至今却没有描述，而且，以上非天然氨基酸应用的最大瓶颈问题来自于其合成的复杂性，目前能够整合至蛋白中的以上非天然氨基酸的合成至少需要五个步骤才能得到产率较低的消旋混合物，而且整个合成过程涉及到重金属催化，致癌溶剂，强酸强碱以及多重纯化步骤。本专利技术中，我们开发了一种高效合成金属螯合非天然氨基酸-3-吡唑基酪氨酸(PyTyr)的方法，该方法仅需两步就可以获得较高产率(50%)的pyTyr，并且不需要经过后续复杂的过柱纯化步骤即可被遗传整合到蛋白质中。水母绿色突光蛋白(Aequoreavictoria green fluorescent protein, GFP)目前被广泛应用于研究生物分子定位和相互作用中，但是在水母中该蛋白的生物功能及机制至今仍在探索研究中。近期，有研究表明GFP可以作为光诱导电子供体，因此在生物体内可能通过感光进而发挥体内电子传递的功能。然而，由于缺乏在目标蛋白的特定位点中加入电子受体的有效方法，导致人们无法深入了解生物体内GFP的电子传递机制。本专利技术拟通过在GFP中定点特异插入pyTyr,使其通过螯合铜离子Cu(II)形成pyTyr_Cu (II)复合物，而PyTyr-Cu(II)可以作为电子受体，与作为电子供体的GFP发色基团产生光诱导电子传递，该研究将为GFP的电子传递机制提供研究基础。本研究现已开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地定点插入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别合适的选择密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择密码子的正交tRNA (Ο-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该Ο-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、氨酰基-tRNA合成酶(RS)、氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号WO 2002/086075，其专利技术名称为 “METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ；W0 2002/085923，其专利技术名称为 “ IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS”;W0 2004/094593，其专利技术名称为“EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE”。定点特异插入非天然氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其他讨论还可参见Wang和Schultz, Chem.Commun.(Camb) 1:1-11(2002)；Wang 和 Schultz, Angewandte Chemie Int.Ed.44(I):34-66 (2005) ；Xie 和 Schultz,Methods 36(3):227-238(2005) ；Xie 和 Schultz, Curr.0pinion in Chemical Biology9 (6):548-554 (2005) ；ffang 等，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.35:225-249 (2006)。
技术实现思路
1、技术问题本专利技术提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其含有的氨基酸序列选自由SEQ IDNO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。这种氨酰基-tRNA合成酶突变体能够用3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化与之配对的正交tRNA，从而在翻译的氨基酸序列中插入3-吡唑基酪氨酸。这是本专利技术人首次发现的，相应地，在本专利技术中将其命名为正交3-吡唑基酪氨酸氨酰基-tRNA合成酶(pyTyrRS)。本专利技术涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3_吡唑基酪氨酸定点特异插入目标蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本专利技术还涉及用这种翻译系统和这种方法产生的含有3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质及其应用。因此，本专利技术的目的在于提供利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将3-吡唑基酪氨酸定点特异插入蛋白质的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，并且提供该翻译系统在目标蛋白质中定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的方法。本专利技术还提供利用本专利技术的3-吡唑基酪氨酸翻译系统产生的含有至少一个3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质。在本专利技术的优选方面中，本专利技术人利用这种方法将3-吡唑基酪氨酸定点本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种正交氨酰基?tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ?ID?NO：3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。
【技术特征摘要】
1.一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:3所示氨基酸和它们的保守性变体构成的组。2.一种3-吡唑基酪氨酸翻译系统，所述系统包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶；和 (iii)正交tRNA，其包含SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA。3.如权利要求2所述的翻译系统，其还包含(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。4.如权利要求2所述的翻译系统，其特征在于，所述正交tRNA是琥珀抑制型tRNA，并且所述选择密码子是琥珀密码子，并且其还包含编码正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列。5.一种宿主细胞，其包含所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列，并且该所述宿主细胞是真细菌细胞，优选大肠杆菌细胞。6.一种产生在至少一 个所选位置定点特异插入3-吡唑基酪氨酸的突变蛋白质的方法，所述方法包括下述步骤: (a)提供权利要求3所述的3-吡唑基酪氨酸翻译系统，该系统包含: (i)3-吡唑基酪氨酸； (?)权利要求1所述的正交氨酰基-tRNA合成酶； (iii)正交tRNA，其包含SEQID NO:1所示的多核苷酸序列；其中所述正交氨酰基-tRNA合成酶用所述3-吡唑基酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA ;和 (iv)编码所述目标蛋白质的核酸，其中所述核酸在所选的位置包含所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子；和 (b)将所述正交tRNA序列和编码所述正交氨酰基-tRNA合成酶的核苷酸序列转化到适当的宿主细胞中，然后将编码所述目标蛋白质的核酸转化到所得到的宿主细胞中，在培养基中加入3-吡唑基酪氨酸，在所述蛋白质的翻译期间，3-吡唑基酪氨酸氨酰化的正交t...
【专利技术属性】
技术研发人员：王江云，刘晓红，李家松，董建树，胡诚，龚为民，江欢欢，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。