一种去除疫苗中宿主DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的pH值和盐浓度，使pH值在pH?6~8之间，盐浓度在0.2~0.5mol/L之间；使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。采用本发明专利技术所述方法处理后，病毒量检测结果显示细胞培养上清浓缩液中检测的病毒量至少是处理前的60%，上清浓缩液中DNA的去除率在99%以上，最终的纯化病毒液制备冻干疫苗检测到宿主DNA残留量不高于10pg，完全符合疫苗中宿主DNA残留量标准，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种去除疫苗中宿主DNA的方法
本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种疫苗中宿主DNA的去除方法。
技术介绍
狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布广泛，每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，其中约95%发生在亚洲和非洲。大多数死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬伤所致，受害者中30%~60%为15岁以下儿童。狂犬病的预防和治疗通常采用狂犬病疫苗。在狂犬疫苗生产中，经病毒感染的细胞培养上清液中含有目标物狂犬病毒，而且还有宿主细胞碎片和蛋白以及宿主DNA。另外，还有细胞培养基组份。这些杂质都是需要去除的。其中，以传代细胞制备狂犬疫苗安全性的关键是细胞残余DNA的含量。中国药典规定狂犬疫苗(Veix)细胞)的宿主DNA残留量不得高于IOOpg/剂。传统的狂犬病毒纯化路线主要采用超滤浓缩和凝胶过滤色谱法。其中，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法，但是该方法的纯化效果并不能满足狂犬疫苗制品新的国家标准IOOpg/剂的要求，主要原因是凝胶过滤色谱法是根据生物分子量大小进行分离的，而病毒与宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝胶介质中被有效分离。此外，采用在病毒收获液中添加硫酸鱼精蛋白的方法去除DNA，原理是硫酸鱼精蛋白可以与DNA结合，结合物容易沉淀，使用离心的方法能有效去除DNA。但是同时鱼精蛋白也与病毒结合，病毒损失严重，通常回收率只有25-30%。此外，在超滤浓缩后加入核酸酶处理步骤，经过酶切以后的DNA变成了小片段，然后再经过凝胶过滤色谱步骤，使大部分DNA和病毒分离开。但是由于核酸酶的作用受环境条件限制，不能完全发挥效果，仍有极小一部分DNA不能和病毒分开，最终DNA残留量还停留在纳克(ng)级水平。结果只是接近国家标准，仍然很难达到合格水平。近几年，在狂犬病毒的纯化过程中引入了离子交换色谱步骤，首先是阴离子交换色谱，让DNA和病毒一起被吸附在介质上，然后控制条件仅对病毒洗脱，能够使病毒液中DNA的残留量降低至500pg/ml，但是病毒量的回收率只有大约20%。CN102282253A公开了一种狂犬病病毒纯化方法，使用一步阳离子交换色谱法能够使DNA的去除率达到95%以上，而病毒回收率在70%以上。所述的阳离子交换介质是MERCK公司的产品Fractogel EMD S03_，结合后续的核酸酶处理步骤和超速离心纯化步骤，最终得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU有效剂量里DNA残留量小于20pg。整个纯化过程病毒回收率在50%左右。然而，CN102282253A公开的狂犬病病毒纯化工艺过于复杂，生产成本高。CN102282253A公开了采用离子交换色谱纯化狂犬病病毒的工艺，先将被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，以便让狂犬病毒结合在担体上，随后从担体上洗脱该病毒。这样的工艺流程主要是为了去除病毒液中的宿主DNA残留，但是由于病毒先吸附再洗脱的做法使得病毒量损失较大。而且病毒和宿主DNA都吸附在担体上，先后洗脱病毒和DNA的做法也导致了 DNA去除不彻底的后果。因此开发一种既能有效去除DNA残留从而达到国家药典标准又能提高病毒回收率的纯化工艺非常重要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括:步骤I)调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的pH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间；步骤2)使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。细胞培养上清浓缩液在与介质接触之前要进行澄清和浓缩，调整后的上清浓缩液pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间。上清浓缩液pH值优选在广8之间，进一步优选在7~7.8之间；盐浓度优选0.3~0.5mol/L。pH值的区间是狂犬病毒的活性耐受区间，越过这个区间病毒生物活性会受到很大影响。盐浓度区间则是病毒回收和DNA去除的优选区间，当盐浓度低于0.2M/L时，病毒的回收率只有8% ;而当盐浓度高于0.5M/L时，DNA的去除率下降到70%。阴离子交换色谱介质选自偶联二乙胺基乙基(DEAE)、季铵盐(Q)为配基的琼脂糖微球或者是其他具有阴离子效果的介质。本专利技术采用的阴离子交换层析并不需要依赖特定的填料，任何具有阴离子效果的介质都可以运用到本专利技术的工艺中。在本专利技术的实施例中米用了 Q Sepharose FF和DEAE Sepharose FF这两种为最普遍的因离子交换色谱介质。Q Sepharose FF为强阴离子交换介质，DEAE Sepharose FF是弱阴离子介质，两者均可用于本专利技术的工艺中而且去除宿主DNA效果良好。在本专利技术的【具体实施方式】中，所述宿主细胞为Veix)细胞，所选用疫苗为狂犬疫苗。Vero细胞是一种理想的疫苗生产基质:遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，160代以内没有致瘤性，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量细胞的均质性和安全性。目前用VeiO细胞作为宿主细胞开发、研究和生产的疫苗包括但不限于狂犬疫苗、流感疫苗、出血热疫苗、甲肝疫苗、乙脑疫苗、轮状病毒疫苗、SARS疫苗等等。CHO细胞与VeiO细胞被WHO是经中国药品监督管理局认可，用于生物制品的生产的传代细胞。本领域技术人员理解，所述疫苗包括但不限于狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙脑疫苗、甲肝疫苗、出血热疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或轮状病毒疫苗，所述宿主细胞包括但不限于CHO细胞与VeiO细胞，利用本专利技术所述方法处理，调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的PH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间；使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触，均可达到去除疫苗中宿主DNA的目的。采用本专利技术所述方法处理后，细胞培养上清浓缩液中检测的病毒量至少是处理前的60%，优选至少是处理前的80%以上，病毒量检测是采用ELISA方法对病毒的G蛋白组分做的检测。接触介质后上清浓缩液中DNA的去除率在99%以上，优选99.5%以上，更优选99.9%以上，DNA检测采用斑点杂交法。所述狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，在阴离子交换色谱步骤之后优选还包含核酸内切酶处理步骤。核酸内切酶可以选自Benzonase等品牌的内切酶。酶切后的病毒液经过凝胶过滤层析纯化，收集含有病毒成分的纯化吸收峰，凝胶过滤介质是4-6%交联度的琼脂糖微球。凝胶过滤层析纯化液中检测的病毒量是层析前的78%以上，有的高达95%以上。凝胶过滤层析纯化液中宿主DNA残留量小于40pg/ml。上述方法得到的纯化液以单剂量配苗并进行冻干，检测到冻干疫苗宿主DNA残留量< IOpg/ 剂。最终的纯化病毒液以单剂量配苗，然后进行冻干。冻干疫苗有效剂量为8IU (NIH法检测)时,用斑点杂交法检测宿主DNA残留量不高于10pg。本专利技术提供的更具优势的狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，通过对阴离子交换色谱进行了仔细的实验摸索，意外的发现狂犬病毒不适合被吸附后再洗脱下来，为此，专利技术人采用严格控制阴离子交换条件的思路，通过调整病毒感染的宿主细胞培养上清浓缩液的PH值和盐浓度，仅仅使宿主DNA被吸附，而病毒几乎不受损失，这一思路达到非常好的去除宿主DNA的效果，与现有技术相比，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括以下步骤：步骤1）调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的pH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2~0.5mol/L之间；步骤2）使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。

【技术特征摘要】
1.一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括以下步骤: 步骤I)调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的PH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间； 步骤2)使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。2.根据权利要求1的方法，所述盐浓度为在0.3^0.5mol/L之间。3.根据权利要求1的方法，所述上清浓缩液的PH值选自7-8或7-7.8。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述阴离子交换色谱介质选自偶联二乙胺基乙基或者季铵盐为配基的琼脂糖微...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜笑寒，周童，贾芳苗，戚凤春，何荣，
申请(专利权)人：江苏先声药物研究有限公司，江苏先声卫科生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：