一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌，通过基因工程对酿酒酵母中调控因子Gln3p进行改造，具体策略是对Gln3p核定位序列上的磷酸化位点进行突变，突变为Gln3p核定位序列上3个磷酸化位点，分别为第344、347和355位的丝氨酸。为了获得更好的技术效果，可进一步去除Gln3p与上游调控因子相结合的核定位调控区域，通过截短表达去除C末端调控序列的Gln3p，表达序列为1-653。在黄酒模拟体系检测本发明专利技术提供的工程菌其EC产生量下降了62%。此外，发酵结束后检测发酵液中其他成分的含量发现，主要成分含量均未发生显著的变化，不会对菌株发酵特性及生长特性产生影响。

【技术实现步骤摘要】
一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种低产氨基甲酸乙酯的酵母代谢工程菌及其构建方法，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
我国传统发酵行业历史悠久，影响深远。传统发酵产品复杂多样，覆盖面广，如食醋，酱油，豆豉、腐乳、白酒、黄酒等已形成较大规模，渗透在人们饮食生活的方方面面。尤其是享有酒中瑰宝，液体蛋糕之称的黄酒消费市场日益扩大，逐渐流行于世界各国，被国家列为重点扶植和发展的饮料酒之一。然而研究发现，发酵过程中含氮化合物的不完全代谢会产生氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,简称EC)等危害人们健康的胺(氨)类物质，严重影响了我国的人民健康、出口贸易和国际形象。 EC是发酵食品中影响最为广泛的一类有害胺(氨)类物质。20世纪早期，人们发现EC可以在体外抑制细菌、植物组织，和鼠的癌细胞的生长，因此其在一段时间内被用作抗肿瘤药。但在随后的研究中，EC被发现有潜在的致癌性。研究结果表明在EC刺激下，小鼠、大鼠、仓鼠、猴子等测试动物都会被诱发良性或恶性肿瘤。在2007年，国际癌症研究机构提出将EC列入2A级致癌物质，与甲醛在同一级别。目前EC只可以用于科学研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌，通过基因工程对酿酒酵母中调控因子Gln3p进行改造，具体策略是对Gln3p核定位序列上的磷酸化位点进行突变。所述突变为Gln3p核定位序列上3个磷酸化位点，分别为第344、347和355位的丝氨酸。为了进一步降低EC产量，在对Gln3p核定位序列上的磷酸化位点进行突变的基础上，去除Gln3p与上游调控因子相结合的核定位调控区域，通过截短表达去除C末端调控序列的Gln3p,表达序列为1-653。获得上述酵母工程菌的方法，其特征在于具体步骤如下:I)从酵母基因组中克隆获得长度1959bp的去除C末端调控序列的GLN3基因片段；连接到T载体构建质粒T-GLN3，并转化至E.coli JM109菌株中；2)使用突变试剂盒对步骤I中质粒T-GLN3上的GLN3基因的磷酸化位点进行突变，将突变后的质粒转化至E.coli JM109菌株中，保藏菌株；3)对步骤2)改造后的T-GLN3质粒，克隆到质粒pYX212，构建质粒pYX212_GLN3 ；4)将步骤3)获得的pYX212-GLN3质粒，转化至S.cerevisiae CEN PK2中，经菌落PCR验证后，得到构建好的基因工程菌株。本专利技术提供的改造后酿酒酵母工程菌，尿素利用能力大幅提升。在黄酒模拟体系中，与野生菌株相比，工程菌发酵液中尿素和EC的含量分别下降了 70%和62%，实现了降低黄酒中EC形成的目的。【附图说明】表1本专利技术中的所有弓丨物表2基因工程菌与野生菌黄酒模拟体系中主要成分含量检测结果图1扩增GLN3和GLN3H基因的电泳检测图图2Gln3p核定位序列突变和核定位调控序列缺失对尿素代谢基因影响定量PCR检测结果图3基因工程菌与野生菌尿素代谢基因定量PCR检测结果图4基因工程菌与野生菌摇瓶发酵尿素利用情况检测结果图5基因工程菌与野生菌黄酒模拟体系中EC含量检测结果具体实施方法实施例1调控因子Gln3p核定位序列突变对菌株尿素代谢基因表达量的影响构建方法如下:1)以GLN3-F和GLN3_R(详见表1)引物从酿酒酵母的基因组中扩增得到获得长度2193bp的GLN3基因片段(图1)。将PCR扩增得到的GLN3基因经胶回收纯化后，与pMD19_TVector(Takara)连接,并转化至E.coli JM109中。在氨节青霉素抗性平板上经菌落PCR挑选转化的阳性克隆T-GLN3，送至上海生工测序验证。将经测序验证序列正确的菌株，甘油管-20°C保存；2)将上一步保存的菌株经活化后，提取T-GLN3质粒。以T-GLN3质粒为模板，表1中的突变引物为引物，按照宝生物公司的MutanBEST点突变试剂盒说明书操作，将Gln3p上的344位，347位和355位Ser位点均突变为丙氨酸。将所得T-GLN3S344A, S347A, S355A 质粒转化至E.coli JM109中，并送至上海生工测序验证。将经测序验证序列正确的菌株，甘油管_20°C保存；3)提取构建好的 T_GLN3S344A，S347A，S355A 和保存的 pYX212 质粒，经 Nco I 及 Sac I 双酶切后分别胶回收。将回收得到的GLN3S344A，S347A，S355A片段与线性化的PYX212质粒连接，并转化至E.coli JM109中。经过扩增培养后提取构建好的PYX212-GLN31-653，S344A, S347A, S355A 质粒转化至S.cerevisiae CEN PK2菌株。经酵母菌落PCR筛选得到阳性克隆后，甘油管_20°C保存。为了检验Gln3p核定位序列突变的效果，用实时定量PCR的方法在转录水平检测了酿酒酵母尿素代谢基因(DUR1，2和DUR3)表达量的变化情况。实验以野生菌株为对照，结果如图2所示。实验结果表明在谷氨酰胺存在的情况下，在表达了 pYX212-GLN3，S344A, S347A,S355A质粒的菌株中，DURl, 2和DUR3的表达量分别提高了 2.4和1.8倍。说明对Gln3p核定位序列的突变可以提闻尿素代谢相关基因的表达量。实施例2调控因子Gln3p核定位调控序列缺失对菌株尿素代谢的影响构建方法如下:1)以GLN3-F’和GLN3-R’ (详见表1)引物从酿酒酵母的基因组中扩增得到获得长度1959bp的GLra1.基因片段(图1)。将PCR扩增得到的GIi^V653基因经胶回收纯化后，与pMD19-TVector (Takara)连接，并转化至E.coli JM109中。在氨节青霉素抗性平板上经菌落PCR挑选转化的阳性克隆T-GIi^V653,送至上海生工测序验证。将经测序验证序列正确的菌株，甘油管_20°C保存；2)提取构建好的T-GIi^V653和保存的PYX212质粒，经Nco I及Sac I双酶切后分别胶回收。将回收得到的GIi^V653片段与线性化的PYX212质粒连接，并转化至E.coliJM109中。经过扩增培养后提取构建好的PYX212-GLN3H质粒转化至S.cerevisiae CENPK2菌株。经酵母菌落PCR筛选得到阳性克隆后，甘油管_20°C保存。 为了检验Gln3p核定位调控序列缺失的效果，用实时定量PCR的方法在转录水平检测了酿酒酵母尿素代谢基因(DUR1，2和DUR3)表达量的变化情况。实验以野生菌株为对照，结果如图2所示。实验结果表明在谷氨酰胺存在的情况下，在表达了 PYXZ^-GLNSh653质粒的菌株中，DURl, 2和DUR3的表达量分别提高了 3.3和2.6倍。说明Gln3p核定位调控序列的缺失也可以提高尿素代谢相关基因的表达量，而且效果比对Gln3p核定位序列进行突变还要好。实施例3更优低产EC酵母工程菌的构建在对Gln3p核定位序列进行突变和核定位调控序列进行均取得正向结果的基础上，将两种方法结合构建更优低产EC的酵母工程菌。构建方法如下:以实施例2中构建的T-GIi^V653质粒为模板，表1中的突变引本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌，其特征在于通过基因工程对酿酒酵母中调控因子Gln3p进行改造，具体策略是对Gln3p核定位序列上的磷酸化位点进行突变。

【技术特征摘要】
1.一种低产氨基甲酸乙酯的酿酒酵母工程菌，其特征在于通过基因工程对酿酒酵母中调控因子Gln3p进行改造，具体策略是对Gln3p核定位序列上的磷酸化位点进行突变。2.如权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述突变为Gln3p核定位序列上3个磷酸化位点，分别为第344、347和355位的丝氨酸。3.根据权利要求2所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于进一步去除Gln3p与上游调控因子相结合的核定位调控区域，通过截短表达去除C末端调控序列的Gln3p，表达序列为1-653。4.获得权利要求3所述酿酒酵母工程菌的方法，其特征在于具体步骤如下: 1)从...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，周景文，赵鑫锐，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：