本发明专利技术涉及免疫抑制药物领域，涉及IL-21在制备免疫抑制剂中的用途和IL-21促进调节性B细胞（B10）分化和IL-10分泌的方法。本发明专利技术通过相关实验，结果表明，IL-21主要通过诱导磷酸化-STAT3的活化促进IL-10分泌，其诱导产生的IL-10能抑制体外T细胞的增殖、具有免疫抑制的作用；所述IL-21可作为体外扩增B10细胞的细胞因子，进一步用于制备治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等自身免疫性疾病的药物。
【技术实现步骤摘要】
IL-21在制备免疫抑制剂中的用途
本专利技术涉及免疫抑制药物领域，涉及IL-21在制备免疫抑制剂中的用途，所述IL-21通过促进调节性B细胞(B10细胞)的分化和促进具有免疫抑制作用的IL-10的分泌，进一步用于制备治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等自身免疫性疾病的药物。
技术介绍
自身免疫性疾病是目前较常见的累及人类健康的疾病，常伴有多器官多系统的损伤，其目前发病机制尚不清楚。临床实践中对自身免疫性疾病的治疗，常采用激素和各种免疫抑制剂进行治疗，常用药物包括；糖皮质激素、环孢素A、酶酚酸酯、环磷酰胺和雷公藤等，但长期使用可诱发一系列的副作用，如长期大量的激素使用可诱发和加重冠心病、糖尿病、股骨头坏死、胃溃疡、青光眼、致命性侵袭性真菌感染和结核感染等；其中，所述的环磷酰胺属细胞毒性抗肿瘤药物，其可诱导骨髓抑制，导致血小板和白细胞减少，出血性膀胱炎、诱发肿瘤和生殖抑制；所述环孢素A和酶酚酸酯具有较强的免疫抑制作用，但价格昂贵，长期使用导致机会感染概率增加，且耐药菌、病毒、真菌和结核感染可能性明显增多；而雷公藤的较强生殖抑制和骨髓抑制也限制了其广泛应用；目前，寻找安全而有效的治疗方法和药物对自身免疫性疾病的长期治疗尤为重要。有报道指出，调节性B细胞是近年来新发现的一群具有免疫调节作用的B细胞，因其膜标记为⑶5+CDldhigh并主要分泌抑制性的细胞因子IL-10，故又称为BlO细胞。研究显示，所述BlO细胞在自身免疫性疾病发病过程中起关键的调控作用，如在自身免疫性疾病的动物模型中BlO细胞的减少或缺失可导致系统性红斑狼疮(SLE)、胶原诱导关节炎(CIA)、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等的病情加重。研究还显示，所述BlO细胞数量较少，只占正常小鼠脾脏B细胞的1-3%，占小鼠外周血细胞的0.4-0.8% ;有研究显示，通过输注BlO细胞或细胞因子IL-10可缓解系统性红斑狼疮鼠的发病，结果表明，BlO细胞及其分泌的IL-10具有治疗SLE等自身免疫性疾病的潜力；然而BlO细胞体内数量较少，体外扩增困难，进而限制了其临床的使用。已知白细胞介素-21 (IL-21)是滤泡辅助T细胞(Tfh)、Thl7细胞等效应性T细胞分泌的细胞因子。有研究认为IL-21与SLE等自身免疫性疾病的发病相关，IL-21主要与生发中心的产生，B细胞的分化、浆细胞的成熟和自身抗体的分泌密切相关。目前国内外还不清楚IL-21是否能促进BlO细胞的分化和IL-10的产生，也未见有关IL-21是否通过诱导BlO的产生发挥免疫调节的作用进而对SLE等自身免疫性疾病起治疗作用报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供IL-21在制备免疫抑制剂中的新的用途，具体涉及IL-21通过促进调节性B细胞(B10细胞)的分化和促进具有免疫抑制作用的IL-10的分泌，进一步用于制备治疗系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病等自身免疫性疾病的药物。本专利技术中，IL-21能促进BlO细胞分化和IL-10的分泌，其中，所述IL-21主要通过诱导磷酸化-STAT3的活化促进IL-10分泌；本专利技术通过以下实验证实所述的IL-21能促进BlO细胞分化和IL-10的分泌的新用途:(I)体外 IL-21 促进 BlO 中 IL-1OmRNA 的表达米用免疫磁珠分选小鼠脾脏中的幼稚B淋巴细胞并培养,在培养液中加入IOng/ ml LPS和10ng/ml IL-21，培养5小时或24小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA 和 500ng/ml ionomycin和 20 u g/ml brefeldin A ;通过real-time RT-PCR检测 IL-1OmRNA 的表达，结果显示，IL-21能时间依赖的促进BlO细胞中IL-1OmRNA的表达(如图1所示)；(2)体外 IL-21 促进 BlO 分泌 IL-10培养幼稚B淋巴细胞，在培养液也中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48 小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin ;通过ELISA检测培养上清中IL-10的分泌量，结果显示，IL-21能促进BlO细胞分泌IL-10 (如图2所示)；(3)体外IL-21促进BlO中STAT3 mRNA的表达和蛋白的磷酸化培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21，培养48小时，最后 5 小时在培养液中加入 50ng/ml PMA、500ng/ml ionomycin 和 20 u g/mlbrefeldin A ;通过real-time RT-PCR检测STAT3mRNA的表达，或单独使用IL-21刺激B细胞不同时间，通过蛋白质印迹(Western blot)检测结果STAT3和磷酸化-STAT3蛋白的表达；结果显示，IL-21能促进BlO细胞中STAT3的表达和STAT3的磷酸化(如图3和4所示)；(4) STAT3的抑制剂(AG490)抑制体外IL-21诱导的磷酸化-STAT3的表达培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml IL-21或50 y M STAT3抑制剂 AG490,分别刺激15分钟、45分钟和60分钟后收取细胞，通过Western blot检测磷酸化-STAT3的表达；结果显示，IL-21能促进磷酸化-STAT3的表达而AG490能抑制IL-21诱导的磷酸化-STAT3的表达(如图5所示)；(5)抑制磷酸化-STAT3的表达能抑制IL-21诱导的IL-10的分泌培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21或 50 u MSTAT3抑制剂AG490，培养24或48小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和 500ng/ml ionomycin ;通过ELISA检测培养上清中IL-10的分泌量,或加入10ng/ml、20ng/ ml、50ng/ml不同剂量的IL-21和50 u MAG490刺激48小时，最后5小时在培养液中加入 50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin,通过ELISA检测上清IL-10的表达，结果显示,抑制磷酸化-STAT3的表达能时间和剂量依赖的抑制IL-21诱导的BlO细胞分泌IL-10 (如图6 和7所示)；(6) IL-21诱导的IL-10能抑制T细胞的增殖培养幼稚B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/ml LPS和10ng/ml IL-21刺激48 小时，最后5小时在培养液中加入50ng/ml PMA和500ng/ml ionomycin,收集培养上清以备后用；培养幼稚性T细胞，在培养液中加入20%的上一步收集的培 养上清；部分孔中加入 20 u g/ml ant1-1L-21中和抗体，通过MMT检测T细胞的增殖，结果显示，IL-21诱导的BlO 细胞分泌的IL-10能抑制T细胞的增殖，而中和了 IL-10的效应能抑制其对T细胞增殖的影响(如图8所示)。本专利技术进一步提供了一种能促进BlO细胞分化和IL-10分泌的方法；所述方法采用IL-21促进BlO细胞的分化和IL-10的分泌，其中，IL-21诱导产生本文档来自技高网...
【技术保护点】
IL?21在制备免疫抑制剂中的用途。
【技术特征摘要】
1.1L-21在制备免疫抑制剂中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫抑制剂是预防和治疗自身免疫性疾病的免疫抑制药物。3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或硬皮病。4.一种IL-21促进BlO细胞分化和IL-10分泌的方法，其特征在于，其包括步骤: (1)培养幼稚性B淋巴细胞，在培养液中加入10ng/mlLPS和10ng/ml IL-21，培养48小时， (2)步骤(1)培养的后5小时，在培养液中加入50ng/mlPMA和500ng/ml ionomyc...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨雪，邹和建，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：
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