一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法制造技术

一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法，属于免疫分析技术领域。本发明专利技术应用鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311和光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS混合免疫7周龄BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得10株LPS单克隆抗体，分别标记HRP，并以鼠伤寒沙门氏菌进行两两配对。以6E2CGMCCNo.7206单抗作为包被抗体和酶标抗体，以鼠伤寒沙门氏菌为标准品建立了夹心ELISA方法，LOD为500cfu/mL。用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体建立的夹心法灵敏度高，成本低，与肠炎沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、E.coli、E.coliO157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中鼠伤寒沙门氏菌检测提供了快速高效的分析手段。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，属于免疫分析
。本专利技术应用鼠伤寒沙门氏菌ATCC13311和光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS混合免疫7周龄BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选得10株LPS单克隆抗体，分别标记HRP，并以鼠伤寒沙门氏菌进行两两配对。以6E2CGMCCNo.7206单抗作为包被抗体和酶标抗体，以鼠伤寒沙门氏菌为标准品建立了夹心ELISA方法，LOD为500cfu/mL。用理化性质高度均一、特异性好、可大量制备的单克隆抗体建立的夹心法灵敏度高，成本低，与肠炎沙门氏菌、亚利桑那沙门氏菌、E.coli、E.coliO157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌无交叉反应，为食品中鼠伤寒沙门氏菌检测提供了快速高效的分析手段。【专利说明】
本专利技术涉及了，属于免疫分析
。
技术介绍
沙门氏菌(Salmonella)是一种全球性的食源性致病菌。生物学上沙门氏菌是一类两端钝圆的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，主要抗原有O抗原、H抗原、Vi抗原。动物性食品如禽肉、蛋类、乳品容易污染沙门氏菌。人体摄入含菌食物后会引起急性肠胃炎、伤寒，免疫力低下的儿童等人群中甚至出现败血症等症状。沙门氏菌有2000多种血清型，临床中常见的血清型主要是肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌等。良好规范的生产操作过程和危害分析与关键点控制(HACCP)等管理体系的应用可以很大程度上减少食源性致病菌的发生。然而对原料和生产过程、产品的质量监测也是保障食品生物安全的重要过程。目前检测沙门氏菌的方法主要有培养法、免疫学检测方法、分子检测方法。传统的生化培养法是检测沙门氏菌的国标方法，尽管权威可靠，但一般需要5-10天得到结果，且操作过程繁琐，不能适应快速检测的要求；分子检测方法是基于沙门氏菌脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶链式反应(PCR)建立起来的。目前发展为传统PCR、实时荧光定量PCR(RT-PCR)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。与传统PCR相比，RT-PCR具有实现定量检测目标DNA、特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。LAMP方法具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方面不亚于常规PCR技术，不依赖专门的仪器设备，可以现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR。然而，有文献报道LAMP方法在检测牛乳中的沙门氏菌时，会出现假阴性的问题。这可能是与引物受到样品基质影响所引起的。同样常规PCR和实时PCR也面临着检测成本高、对操作人员技术要求较高的问题。免疫学检测方法主要有酶联免疫反应(ELISA)、免疫层析试纸条(Immunochromatographic test strip)。ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点成为食源性致病菌的常规检测方法。抗体的亲和力、交叉反应、稳定性对于ELISA方法的灵敏度和特异性有着关键性的决定作用。虽然胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，但一般而言，ELISA比胶体金试纸条具有更好的灵敏度，而且更适合高通量检测，因此ELISA也具有相当广泛的应用空间。作为食品安全事件中常见的致病血清型，鼠伤寒沙门氏菌的检测也是非常重要的。本专利技术首次采用LPS和菌体混合免疫的方法，成功制备了高灵敏的鼠伤寒沙门氏菌LPS的单克隆抗体并应用一株单克隆抗体就实现了鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法检测。成功制备抗体与采用的免疫原是密不可分的，单纯的通过菌体免疫制备沙门氏菌的单克隆抗体是比较困难的。作为沙门氏菌的主要抗原，LPS是有潜力的检测抗原，但LPS的免疫原性较弱，在小鼠体内很难引起足够的免疫应答。而沙门氏菌菌体表面均匀分布着大量的LPS，因此我们将鼠伤寒沙门氏菌LPS和鼠伤寒沙门氏菌菌体混合免疫取得了较好的效果。应用一个单克隆抗体即可实现高灵敏的双抗体夹心法检测这是与抗体较高的亲和力以及沙门氏菌表面分布大量LPS所决定的。
技术实现思路
(一 )要解决的技术问题 本专利技术的目的在于建立一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的酶联免疫吸附检测方法，用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的批量、快速检测。( 二 )技术方案 为实现上述目的，本专利技术的技术方案:，步骤为: (O鼠伤寒沙门氏菌LPS单克隆抗体的制备 以混合后的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311菌体和光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS为免疫原，免疫7周龄的BALB/c小鼠，免疫程序如下:第一周进行首免，(10~8cfu鼠伤寒沙门氏菌菌体+100 μ g鼠伤寒沙门氏菌LPS) /只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，(10~8cfu鼠伤寒沙门氏菌菌体+100 μ g鼠伤寒沙门氏菌LPS)/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，(10~7cfU鼠伤寒沙门氏菌菌体+50 μ g鼠伤寒沙门氏菌LPS)/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，挑选对鼠伤寒沙门氏菌LPS效价最高的老鼠；第九周进行冲刺免疫，30 Ug鼠伤寒沙门氏菌LPS/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合、筛选，共筛选得10株LPS单克隆抗体； 我们购买的菌株是CICC 10420 (CICC为中国工业微生物菌种保藏中心)，菌株对应的ATCC编号为ATCC 13311，该沙门氏菌为ATCC 13311.从网站信息可见所购菌株为salmonella typhimurium即专利中的鼠伤寒沙门氏菌。LPS购于sigma公司，货号为L6511。详细信息可见公司网站:http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/1651l?lang=zh&region=CN (2)单克隆抗体的配对筛选 将纯化后的10株LPS单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下:包被抗体5 μ g/mL ;包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度10~7cfu/mL ;标品稀释液pH7.2,0.01M的PBS ;酶标抗体稀释1000倍使用；在此条件下，实验成功得到了 40对P/N值>5的配对； (3)夹心法的建立 选择检测限稳定、灵敏的配对，以6E2抗体即CGMCC N0.7206分别为包被抗体和酶标抗体建立夹心法；具体参数如下: 抗体包被浓度:5 μ g/mL, 包被液:pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品稀释液:pH7.2、0.01M 的 PBS+0.l%Tween, 检测抗体浓度:1.6 μ g/mL,反应时间:包被、封闭:37°C、2h ;标准品:37°C、lh ;检测抗体:37°C、lh ;显色IOmin ； 优化后鼠伤寒沙门氏菌夹心法LOD:500cfu/mL。建立了一种食品中鼠伤寒沙门氏菌LPS的双抗体夹心检测方法，该方法包括对检测方法的优化。其中，单克隆抗体是采用鼠伤寒沙门氏菌LPS与鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 13311)菌体混合，经过特定免疫程序免疫BA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单克隆抗体的检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的双抗体夹心法，其特征在于步骤为：（1）鼠伤寒沙门氏菌LPS单克隆抗体的制备?????以混合后的鼠伤寒沙门氏菌ATCC?13311菌体和光滑型的鼠伤寒沙门氏菌LPS为免疫原，免疫?7周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合、筛选，得10株LPS单克隆抗体；（2）单克隆抗体的配对筛选将纯化后的10株LPS单克隆抗体分别标记辣根过氧化物酶HRP，直接法鉴定标记成功后进行夹心法配对；配对参数如下：包被抗体5μg/mL；包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液；标品浓度10^7cfu/mL；标品稀释液pH7.2、0.01M的PBS；酶标抗体稀释1000倍使用；在此条件下，实验成功得到了40对P/N值>5的配对；（3）夹心法的建立选择检测限稳定、灵敏的配对，以6E2抗体即CGMCC?No.7206分别为包被抗体和酶标抗体建立夹心法；具体参数如下：抗体包被浓度：5μg/mL，包被液：pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品稀释液：pH7.2、0.01M的PBS+0.1%Tween，检测抗体浓度：1.6μg/mL，反应时间：包被、封闭：37℃、2h；标准品：37℃、1h；检测抗体：37℃、1h；显色10min；优化后鼠伤寒沙门氏菌夹心法LOD：500cfu/mL。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，王文彬，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：