一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于点击化学和具有HRP活性的G四聚体检测铜离子的试剂盒以及检测方法。在反应体系中使用点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列，之后加入高铁血红素和KCl，形成高铁血红素/G四聚体结构。由于高铁血红素/G四聚体具有HRP的活性，能催化其无色底物TMB形成有颜色的底物，实验结果通过肉眼就能判别。定量分析时，将反应终溶液转移到酶标板中，用酶标仪读取溶液在450nm的OD值。本发明专利技术可用于Cu2+的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种基于点击化学和具有HRP活性的G四聚体检测铜离子的试剂盒以及检测方法。在反应体系中使用点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列，之后加入高铁血红素和KCl，形成高铁血红素/G四聚体结构。由于高铁血红素/G四聚体具有HRP的活性，能催化其无色底物TMB形成有颜色的底物，实验结果通过肉眼就能判别。定量分析时，将反应终溶液转移到酶标板中，用酶标仪读取溶液在450nm的OD值。本专利技术可用于Cu2+的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。【专利说明】一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法
本专利技术涉及一种铜离子检测试剂盒，特别涉及一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒。
技术介绍
环境中离子的浓度直接影响人们的健康，过高或过低都会影响人们的健康。在众多的离子中，重金属离子的危害性更大，因此有必要对其含量进行精确的测定。传统的用于检测重金属离子的方法主要有石墨烯原子吸收光谱法(graphitefurnace atomic absorption spectrometry, AAS)和电感稱合等离子原子发射光谱法(inductive coupled plasma atomic emission spectroscopy, ICP-AES)。这两种方法对于重金属离子的检测准确可靠，但使用的仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员来操作，因而限制了其在基层实验室的广泛应用。近年来，各种检测重金属离子的生物传感器不断出现，其检测的原理都是依赖于重金属离子能够切割其DNA酶结合的底物链的特定位点，然后使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法包括:荧光法，比色法，动力学光散射法和胶体金试纸条法等。近年来，基于Cu+的点击化学由于其高效和特异性而得到了广泛的应用，它指的是一个分子的叠氮基团和另一个分子的炔基基团在Cu+的催化下，通过环加成反应形成一个三唑五元环而被连接在一起。并且，叠氮基团和炔基基团的之间的反应不受溶液中其它基团的干扰，特异性好。Cu+可以通过抗坏血酸钠还原Cu2+产生。基于Cu+的点击化学已经用于可视化检测Cu2+，其检测的原理多是基于观察胶体金溶液的变化来间接的反应Cu2+的浓度。但是，有些比色法需要通过改变反应温度才能观察到胶体金溶液的变化，并且，这些方法的灵敏度都有待进一步提闻。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，该试剂盒具有专门设计的能够形成G四聚体的富含G碱基的序列，可形成具有HRP活性的G四聚体，可用于Cu2+的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。本专利技术所述的一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，包括以下成分:两段G四聚体形成序列，第一序列Gl为5’-GTGGGT AGG_N=N=N_3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’ -CH = CH-GCGGG TTGGG-3’，其’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Gu+催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；抗坏血酸钠，粉末形式；PBS反应液，含有0.2M NaCl ;高铁血红素，粉末形式；1MKCl ；0.05% (w/v)H2O2 ；0.05% (w/v)四甲基联苯胺，即TMB ；以及浓H2SO4,作为终止反应液。本专利技术的另一目的还在于提供根据本专利技术所述的铜离子检测试剂盒的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法。本所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法，包括以下步骤:I)将第一序列Gl、第二序列G2、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入PBS反应液中，混匀，20-25反应I小时，使Gl的叠氮基团和G2的炔基基团通过Gu+催化的环加成反应而连接起来，形成一条G四聚体形成序列；2)在上述反应液中加入闻铁血红素和KCl,充分震荡反应，使闻铁血红素和所述G四聚体形成序列形成具有HRP的活性高铁血红素/G四聚体结构；3)在上述溶液中加入H2O2和TMB，所述高铁血红素/G四聚体能够催化无色的TMB形成有色的底物；4)加入浓H2SO4终止反应，观察溶液颜色的变化；如果所述待检测样品含有Cu2+，溶液的初始颜色为无色，加入H2SO4后颜色变为黄色，黄色的深浅可以间接表明Cu2+的浓度；5)将上述液体转移到酶标板中，使用酶标仪读取每个孔中的溶液在450nm处的OD值，对Cu2+的含量进行定量分析。本专利技术所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及铜离子检测方法的优点是:I)检测体系中，避免使用铜离子依赖型DNA酶与其底物DNA链形成酶-底物复合体，简化了操作时间和步骤。2)本专利技术中使用基于Cu+的点击化学，特异性好，不受反应体系中其它化学基团的影响，因此在Cu2+的检测中，对样本的要求低，可以用于实际样品的定量检测。3) Cu+的来源广泛，可以通过抗坏血酸盐还原Cu2+得到。4)检测体系中形成的hemin/G四聚体用具有HRP的活性，能够催化无色的底物TMB生成有颜色的产物，实现检测信号的放大。5)本专利技术所述的方法灵敏度高，对铜离子的检测限为240nM，达到FDA规定的饮用水中铜离子的最低检测限(20 μ M)。6)本专利技术的实验结果用肉眼就能观察到，定量检测不需要使用复杂的仪器，使用普通的酶标仪就能读数。7)本专利技术中所述的用于Cu2+的检测方法具有很高的特异性，其他离子对检测不产生明显的干扰。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的原理图。图2为本专利技术所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的灵敏度实验结果图。图3为本专利技术所述的铜离子检测试剂盒和检测方法的特异性实验结果图。图4为本专利技术所述的铜离子检测试剂盒在自来水和人血清中检测铜离子的回收率结果图。【具体实施方式】下面结合附图，示例性说明本专利技术所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及铜离子检测方法。如图1所示，本专利技术所述的铜离子检测方法的原理是:基于铜离子的点击化学(click chemistry)是指一个分子上的叠氮基团可以和另一个分子上的炔基基团在Cu+ (—价铜离子)的存在下，通过环加成反应连接在一起，形成一个三唑五元环。Cu+可以通过抗坏血酸盐还原Cu2+(二价铜离子)产生。本专利技术所述的G四聚体形成序列是一段富含G碱基的DNA序列，在反应体系中使用基于铜离子的点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列。具体地，本专利技术将能够形成G四聚体的富含G碱基的序列(5’ -GTGGGTAGGG CGGGT TGGG-3’ )分为两小段，分别为 Gl 和 G2。Gl 的序列为 5’ -GTGGGTAGG-N=N=N-3’，其 3’端修饰叠氮(azide)基团；G2 的序列为 5’-CH = CH-GCGGG TTGGG-3’，其5’端修饰炔基(alkyne)基团。当溶液中存在Cu2+时和抗坏血酸钠时，叠氮基团修饰的Gl和炔基基团修饰的G2序列通过Cu+的环加成反应被连接在一起，成为一条G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：两段G四聚体形成序列，第一序列G1为5’?GTGGGT?AGG?N=N=N?3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’?CH≡CH?GCGGG?TTGGG?3’，其’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Gu+催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；抗坏血酸钠，粉末形式；PBS反应液，含有0.2M?NaCl；高铁血红素，粉末形式；1M?KCl；0.05%（w/v）H2O2；0.05%（w/v）四甲基联苯胺，即TMB；以及浓H2SO4，作为终止反应液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾令文，葛晨晨，赵世明，王斗，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：