对虾精子成活率和质量的评价方法技术

本发明专利技术公开一种对虾精子成活率和质量的评价方法。适用于利用化学方法处理后的对虾成活率和精子损伤程度的评价，利用伊红和苯胺黑的混合生物染料，在光学显微镜下清晰区分出死活精子，统计精子成活率；利用单细胞凝胶固定GelRed染色的单个精子，通过电泳将精子DNA分散，可在荧光显微镜下观察到损伤精子DNA的迁移轨迹，再通过CASP分析软件统计彗星率、损伤系数，进而评价对虾精子的损伤程度和质量。本发明专利技术采用比较合适的混合生物染色液，细胞经染色后区别清晰，背景色对观察干扰减小，染色结果易于快速读取，结果准确而特异，并且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子损伤情况，有效准确获得更多对虾精子成活率和质量的评价信息。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一种。适用于利用化学方法处理后的对虾成活率和精子损伤程度的评价，利用伊红和苯胺黑的混合生物染料，在光学显微镜下清晰区分出死活精子，统计精子成活率；利用单细胞凝胶固定GelRed染色的单个精子，通过电泳将精子DNA分散，可在荧光显微镜下观察到损伤精子DNA的迁移轨迹，再通过CASP分析软件统计彗星率、损伤系数，进而评价对虾精子的损伤程度和质量。本专利技术采用比较合适的混合生物染色液，细胞经染色后区别清晰，背景色对观察干扰减小，染色结果易于快速读取，结果准确而特异，并且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子损伤情况，有效准确获得更多对虾精子成活率和质量的评价信息。【专利说明】
本专利技术属于生物细胞活力分析
，涉及一种基于生物染色和核酸染色。
技术介绍
对虾属于节肢动物门、有鳃亚门、甲壳纲、软甲亚纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。凡纳滨对虾是甲壳纲对虾属的主要种类之一。凡纳滨对虾的精子不具有鞭毛，不能运动，由于其所具有的的特征，使对其质量和活力的评价成为一个难题，为此许多研究者正积极完善和发展可靠的甲壳动物精子质量和成活率的评价方法。这些方法包括:精子数目及形态、生物染色、低渗外吐、精卵相互作用、生化分析、精子顶体反应、核酸染色等。 目前，精子生物染色最常用的是台盼蓝染料排斥实验。正常的精子能排斥染料，不被台盼蓝染色；质量差、活力弱或细胞膜完整性被破坏后，台盼蓝会弥散到细胞中。除台盼蓝以外，还有其它的染料，如曙红和苯胺黑等。近年来，染色法已被用于评价甲壳动物精子活力，柯夫亚等(1996)采用台盼蓝和曙红B染料对冷冻保存的中国对虾精子进行评价。Jeyalectunmie (1989)采用曙红和苯胺黑染色对青蟹精荚中精子活力进行了评价,精荚中的死精子细胞呈现粉红色，而活力精子细胞在苯胺黑的红色背景下不着色。Wang等(1995)比较了精子形状、台盼蓝染色、亚丁醇染色及卵水诱导顶体反应这四种技术，未能得到确定的结论，却发现精子形态和亚丁醇染色之间具有很好的相关性。有时将台盼蓝和吉姆萨联合使用，可同时达到区分精子死活、鉴别精子顶体反应的目的。总的来说，染色相斥实验是一种粗略的估计精子成活率的方法，无法区分10%~20%的存活率差异，此外排斥实验后的精子存活力将受到影响。生物染色和形态评价对精子活力的生理和生化功能提供的信息有限，生物染色可能过高估计了活精子的比例，这可能与精荚、精子膜的通透能力及不同色素的通透能力之间存在着差异有关。
技术实现思路
本专利技术的目的:为克服现有对虾精子质量和成活率评价方法中存在误差大、评价效果差、评价信息有限等缺点，提供一种基于生物染色和核酸染色对。该方法采用比较合适的混合生物染色液，背景色对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果快速准确、特异，而且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子的损伤比率，可区分10%~20%的存活率差异，获得更多信息。本专利技术的技术方案如下:一种，该方法步骤包括挑选精荚成熟度好的雄虾精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液。具体操作为:采用lg/L胰蛋白酶消化获得游离的精子，5mL离心管中加入3mL胰蛋白酶溶液和3个精荚，37°C水浴消化5min后，加入ImL15%(V/V)的胎牛血清终止消化反应,500r/min离心IOmin,收集上清平均分配于3个1.5mL的离心管中，2000r/min离心5min,吸弃上清,每管中加入ImL灭菌天然海水轻轻吹打均匀,获得游离的对虾精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的对虾精子。该方法还包括以下步骤: 步骤I)生物染色及精子成活率计算: 使用灭菌天然海水分别配制4飞g/L伊红生物染色液和9(Tl00g/L的苯胺黑的生物染色液，并通过定量滤纸过滤后置于棕色瓶中备用，使用前将伊红生物染色液和苯胺黑的生物染色液等体积混合得到混合染色液，按照混合染色液:精子悬液体积比例为f2ul:8、ul分别取混合染色液和化学处理后精子悬液置于载玻片上混匀，然后在载玻片上盖上盖玻片，室温静置f 5min后，置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率。步骤2 )单细胞凝胶电泳: a、稀释、裂解和消化蛋白:取化学处理后精子悬液5(Tl00ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液2~3次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至4飞X IO6个/mL,取50-?00μ1稀释精液与350μ? 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4°C放置5~lOmin，加入0.5^1.5mL细胞裂解液在4°C裂解f 2h，吸弃细胞裂解液，加入0.5^1.5mL细胞消化液，52飞5°C度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶。b、铺片:pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后在70°C水浴加热3~5min，使含有精 子的低熔点琼脂糖融化成液态得到含有精子的液态凝胶液，取100 μ L含有精子的液态凝胶液加在载玻片上制备双层凝胶。c、DNA双链解旋和电泳:将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中，4°C条件下放置2(T30min后，在电压15~17V、电流10(Tl30mA条件下电泳4(T60min后停止电泳。d、中和、染色:用pH=7.0的0.4 mol/L Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片l(Tl5min，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后于双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品。e、观察记录:将步骤d得到的样品加盖盖玻片置于Nikon 80i型荧光显微镜下，汞灯激发波长为51(T560nm绿光，10X40倍下随机观察、拍照5(Tl00个细胞。步骤3)精子质量评价: 步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的各种参数:彗星拖尾长度L tail (以像素大小表示)、彗星尾部DNA的相对含量Tail DNA、尾距TM、Olive尾距0ΤΜ。尾距 TM:L tailXTail DNA，Olive 尾距 OTM:Tail DNAX 迁移 DNA 中心密度，彗星拖尾长度L tail、彗星尾部DNA的相对含量Tail DNA、尾距TM、Olive尾距OTM这些参数用CASP软件分析时可直接得到。根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数，计算公式:彗星率=(彗星细胞数目/拍照细胞总数目)X 100%;损伤系数=。作为本专利技术的进一步限定，所述的彗星细胞为彗星拖尾长度> 3像素的细胞，，根据彗星尾部DNA的相对含量大小，并结合彗星图像中彗星拖尾、细胞形态情况，将化学法处理后的凡纳滨对虾精子的核DNA损伤程度分5级:0级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量< 5%，无损伤，精子核完整、呈圆形；I级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量5%~20%，轻度损伤，精子核缩小，可见少许彗尾；II级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量20%~40%，中度损伤，精子核进一步缩小，彗尾明显延长JII级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量40%~95%，重度损伤，精子核明显缩小，彗尾较长、荧光信号强而密；IV级损伤的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对虾精子成活率和质量的评价方法，该方法步骤包括挑选成熟度好的雄虾的精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的化学处理后精子悬液，其特征在于，该方法还包括以下步骤：步骤1）生物染色及精子成活率计算：使用灭菌天然海水分别配制4~6g/L伊红生物染色液和90~100g/L的苯胺黑的生物染色液，然后等体积混合得到混合染色液，将混合染色液和化学处理后精子悬液按照体积比例为1~2ul：8~9ul混匀并置于载玻片上，于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率；步骤2）单细胞凝胶电泳：a、稀释、裂解和消化蛋白：取化学处理后精子悬液50~100ul，用磷酸缓冲液PBS离心洗涤后稀释游离精子至4~6×106个/mL，取50~100μl稀释精液与350μL?1%的液态琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，加入细胞裂解液裂解1~2h，离心弃细胞裂解液，加入0.5~1.5mL细胞消化液，52~55℃度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶；b、铺片：磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后水浴加热得到含有精子的液态凝胶液，取100μL液态凝胶液加在的载玻片上制备双层凝胶；c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中进行DNA双链解旋，在电压15~17V、电流100~130mA条件下电泳40~60min后停止电泳；d、中和、染色：用Tris?HCl中和步骤c中电泳后的载玻片，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品；e、观察记录：将步骤d得到的样品加盖盖玻片置于荧光显微镜下，汞灯激发波长为510?560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照50~100个细胞；步骤3）精子质量评价：步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的参数：彗星拖尾长度、彗星尾部DNA的相对含量；彗星拖尾长度＞3像素的细胞为彗星细胞，彗星尾部DNA的相对含量＜5%的为0级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量5%～20%的为Ⅰ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量20%～40%为Ⅱ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量40%～95%的为Ⅲ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量＞95%的为Ⅳ级损伤的细胞；根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数进行精子质量评价，计算公式：彗星率=（彗星细胞数目/拍照细胞总数目）×100%；损伤系数=[（0级损伤的细胞个数×0）+（Ⅰ级损伤的细胞个数×1）+（Ⅱ级损伤的细胞个数×2）+(Ⅲ级损伤的细胞个数×3)+(?Ⅳ级损伤的细胞个数×4)]。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨春玲，陈秀荔，赵永贞，陈晓汉，李咏梅，彭敏，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：