本发明专利技术属生物工程技术应用领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法。该多糖为白色或淡黄色粉末，是金耳斜面菌种通过活化，摇瓶液体发酵，乙醇沉淀，脱蛋白，葡聚糖凝胶柱G-100层析、透析后冷冻干燥得到的。产量为6.6mg/100mL发酵液，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为85.85％，可应用于制备具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属生物工程技术应用领域，具体涉及。该多糖为白色或淡黄色粉末，是金耳斜面菌种通过活化，摇瓶液体发酵，乙醇沉淀，脱蛋白，葡聚糖凝胶柱G-100层析、透析后冷冻干燥得到的。产量为6.6mg/100mL发酵液，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为85.85％，可应用于制备具有抗氧化，防衰老功能的保健品。【专利说明】
本专利技术涉及。属生物工程技术应用领域。
技术介绍
金耳为担子菌纲，银耳目，银耳科，银耳属的干燥子实体，主要分布于我国西藏云南等地，野生资源稀有，古籍文献记载用于肺热、痰多、咳嗽、气喘等症的治疗，具有较高的药用价值。研究表明，金耳深层发酵液中含有人体必需的氨基酸，并且有钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。通过热水浸提获得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可应用于保健品行业。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供本专利技术的技术方案为:将金耳斜面保藏菌种活化，接种至摇瓶种子液体培养基中培养，待菌丝体分散后将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，抽滤收集发酵液，浓缩后乙醇沉淀，脱蛋白、葡聚糖凝胶柱G-200层析、透析后冷冻干燥得到金耳发酵液多糖，最后进行体外抗氧化实验。本专利技术专利技术的金耳发酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。上述技术方案中，摇瓶种子培养基为PDAlL加磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，VBl 10-20mg,pH6.0，发酵培养基为葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氢钾 0.3g/100mL、硫酸镁 0.15g/100mL、VBl l-2mg/100mL, pH6.0，250mL 三角瓶装培养基IOOmL于28°C，220r / min，振荡培养10_14d。多糖提取方法为发酵结束后抽滤取发酵液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的I / 5，加入4倍体积95%乙醇在4°C醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后用Sevage法去除游离蛋白，葡聚糖凝胶G-100层析柱纯化，蒸馏水透析，冷冻干燥后得到金耳发酵液多糖。抗氧化试验将总还原能力，清除羟基自由基、DPPH的能力作为指标。【具体实施方式】下面的实例将具体说明本专利技术的操作方法，但不能作为对本专利技术的限定。实例一1.发酵液制备出发菌种为本实验室金耳斜面保藏菌种；(I)摇瓶种子培养摇瓶种子培养基=PDAlL加磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨lg，VBl10_20mg，pH6.0 ；培养方法:从斜面菌种中取3~4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基IOOmL于28°C，220r / min，振荡培养IOd ;摇瓶中预先装有经过消毒灭菌的玻璃珠，用于打散菌丝体。(2)摇瓶发酵培养发酵培养基:葡萄糖4g/100mL、酵母粉lg/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、VBl l_2mg/100mL，ρΗ6.0 ；培养方法:将培养好的种子以15%的接种量接入摇瓶发酵培养基中28°C，220r /min，振荡培养14d ；(3)发酵液浓缩，醇沉，脱蛋白，凝胶柱层析，透析培养后抽滤，取发酵液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的I / 5，加入4倍体积95%乙醇在4°C醇析过夜，离心收集沉淀物，用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次。待有机溶剂挥发完毕，将沉淀物用蒸馏水完全溶解，用Sevage法去除游离蛋白，具体为按发酵液I / 5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积I / 5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min,收集上清液,反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑池为止。收集上清液用S^hadexG-1OO凝胶层析对多糖进行纯化，流动相为0.1MNaCl,流速0.5mL / min,每管3mL。以苯酹-硫酸法在490nm处检测每管的糖浓度,测定该多糖的纯度。多糖复溶后装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次，然后冷冻干燥，得多糖样品，采用苯酚-硫酸法测总糖含量，为85.85%。 实例二将制备得到的金耳发酵液多糖进行抗氧化活性实验，以蒸馏水为空白对照，以抗坏血酸为阳性对照，数据经SPSS13.0软件分析。1.实验方法(I)还原力测定:在具塞试管中加入1.0mL不同浓度的金耳发酵液多糖样品(50_1000ug/mL)、0.2mLPBS(2.0M, pH6.6)和0.25mLl%铁氰化钾溶液。置50°C恒温水浴中反应20min，迅速冷去卩，再加入0.5mL的10% (w / V)三氯乙酸溶液,3000g离心IOmin,取上清液1.5mL,加入0.1mLl %三氯化铁溶液和3.0mL去离子水，振荡均匀，静置5min，在700nm处以蒸馏水为空白测定其吸光值，吸光值越大，说明其还原力越高。(2)对羟自由基的清除:在试管中依次加入1.0mL不同浓度的金耳菌丝体多糖(发酵液多糖)样品(50-1000ug/mL)，0.9mL 的 FeSO4 (0.15mM)，0.5mL 水杨酸(9mM) 0.5mLH202 (8.8mM)，37°C 反应60min,于51Onm处测得不同多糖浓度下的吸光值Ai ,用水替代多糖样品时的吸光值Aj,用水代替多糖和H2O2时测得空白对照吸光值Atl.按下式计算羟自由基(.0H)的清除率:.0H清除率(％ ) = X 100(3)对DPPH.自由基的清除样品管中加入1.0mL不同浓度的多糖溶液(50_1000ug/mL)与3.0mL的0.004%溶于95%乙醇的DPPH溶液，对照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以上三组置于室温静置30min后，用0.55mL蒸馏水和3.0mL95%的乙醇调零，于517nm处测定吸光值。结果显示:(I)还原力测定:试验组和阴性对照组比较，P < 0.01，显示在还原力方面两者有高度显著性差异，表明其具有一定的还原力；各多糖还原能力随多糖浓度的增加呈现出稳定增长趋势；试验组与阳性对照组相比，P < 0.05，表明多糖的还原力不及抗坏血酸。(2)对羟基自由基的清除:试验组和阴性对照组比较，P < 0.05，显示两者在对羟基自由基的清除方面有显著性差异，表明金耳发酵液多糖具有一定的清除羟基自由基能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，随着多糖浓度的增加，对DPPH自由基清除能力均呈现增长的趋势；试验组与阳性对照组相比，P < 0.05，表明多糖对羟基自由基的清除能力不及抗坏血酸。(3)对DPPH的清除能力:试验组和阴性对照组比较，P < 0.01，显示两者在对DPPH的清除能力方面有高度显著性差异，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，随着多糖浓度的增加，各多糖对羟基自由基清除能力呈稳定的增长；试验组与阳性对照组相比，P < 0.05，表明多糖对DPPH的清除能力不及抗坏血酸。【权利要求】1.，其特征在于多糖外观为白色或淡黄色粉末，是将金耳斜面菌种，移至摇瓶种子培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵培养基培养，发酵结束后，抽滤取发酵液浓缩，乙醇沉本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法，其特征在于多糖外观为白色或淡黄色粉末，是将金耳斜面菌种，移至摇瓶种子培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵培养基培养，发酵结束后，抽滤取发酵液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，凝胶层析柱纯化，透析后冷冻干燥得到金耳发酵液多糖，多糖含量为85.85％，最后进行体外抗氧化实验，显示该多糖具有一定的抗氧化活性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓超，付海田，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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