本发明专利技术公开了一种获得高纯高效的藻毒素降解酶（MlrA）的生物合成方法，属于生物技术应用或环境保护领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：将如SEQIDNO.1所示的序列构建到pMAL-C2X上得到pMAL-MlrA；将pMAL-MlrA转化到大肠杆菌TB1中得到MlrA的表达菌；将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。本发明专利技术通过优化表达载体和表达条件，获得的MBP-MlrA纯度达到90%以上，切除MBP标签后的MlrA纯度可以达到98%以上；通过本发明专利技术得到的藻毒素降解酶降解范围广，降解效率高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种获得高纯高效的藻毒素降解酶（MlrA）的生物合成方法，属于生物技术应用或环境保护领域。本专利技术方法包括如下步骤：将如SEQIDNO.1所示的序列构建到pMAL-C2X上得到pMAL-MlrA；将pMAL-MlrA转化到大肠杆菌TB1中得到MlrA的表达菌；将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。本专利技术通过优化表达载体和表达条件，获得的MBP-MlrA纯度达到90%以上，切除MBP标签后的MlrA纯度可以达到98%以上；通过本专利技术得到的藻毒素降解酶降解范围广，降解效率高。【专利说明】
本专利技术涉及生物技术应用或环境保护领域，具体涉及。
技术介绍
藻毒素(Microcystins，MCs)是蓝藻在生长过程中以及死亡后释放出来的危害严重的一类毒素(Duy T.N.et al.Toxicology and risk assessment of freshwater eyanobacteria (blue-green algae) toxic in water.Rev.Environ.Con tarn.Toxicaol.2000, 163，113-186)，其结构图如图1所示。MCs是一个环状七肽化合物，将整个环状多肽分为7部分:1，D丙氨酸；2，Rl ;3，D-β -甲基异天冬氨酸；4，R2 ;5，Adda ;6，D异谷氨酸；7，N-甲基脱氢丙氨酸。目前已有67种藻毒素被发现，这种不同大都是环状结构中的2、3、4和7位的氨基酸残基不同所造成的。最常见的有MC-LR和MC-RR两种，其中MC-LR的环状结构中2和4位的氨基酸残基分别为赖氨酸残基(L)和精氨酸残基(R)，MC-RR的环状结构中2和4位的氨基酸残基都为精氨酸残基(R)。MCs污染会导致水体动物的死亡，饮用被藻毒素污染的水可诱发人、畜、禽等肝损伤、导致肝癌等。近年来，由于各地水体富营养化程度的提高，蓝藻水华现象频繁爆发，这些生长或死亡的蓝藻会释放出大量的藻毒素，对人类和环境造成的危害日益严重。MCs的去毒或解毒显得尤为迫切。同时由于人们生活水平的提高，对水体治理的安全性、有效性提出了更高的要求。通过去除或降解藻毒素达到解毒目的的方法目前主要有:(I)物理化学降解法:通过凝固、活性炭吸收、膜处理技术或者UV/H202 ClO2降解藻毒素。凝固、活性炭吸收、膜处理技术虽然能部分降低藻毒素在水中的含量，但只能将藻毒素转移到其他的地方并不能有效的将藻毒素降解掉，且耗时耗材料。氧化降解藻毒素的方法虽然降解效率较高，价格便宜，但因为氧化剂的杀生能力强，专一性差，且容易与有机污染物反应产生有害身体健康的物质。(2)细菌降解法:该法利用细沙过滤和含有具有选择性的生物降解菌的生物膜来处理水样，该法经济，但操作繁琐，需要经常更换生物膜，且生物降解菌自身代谢需要消耗养分，容易影响生态系统的稳定性，并可能产生未知次生代谢有毒物质，造成二次污染。(3)生物酶降解法:生物降解酶可以降解藻毒素，使其转变为低毒、无毒的小分子物质，具有专一性、高效性且不会产生有毒物质等特点从而备受关注。生物酶降解藻毒素无疑是目前有效、安全解除藻毒素对水体的污染问题的最优方法之一。1996年Bourne D.G.等报道:通过sp.对MC-LR的降解产物分析，推测降解MC-LR至少有四个酶(MlrA，MlrB, MlrC, MlrD)其中三个水解酶(MlrA，MlrB, MlrC)和一个假定的低聚肽传输因子(MlrD)，并推测出一种可能MC-LR降解途径.第一个酶MlrA是一个非常重要的酶，将环状藻毒素降解为线状藻毒素，使得藻毒素毒性降低了近 160 倍(Bourne D.G., et al.Enzymatic pathway for the bacterialdegradation of the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR.App1.Environ.Microbiol.1996，62，4086-4094.)。2001 年 Bourne D.G.等克隆了这四个基因，并对这四个基因进行了序列测定及表征。2012年Hai Yan等}~k Sphingopyxis sp.中克隆了基因USTB-05-A，并将该基因USTB-05-A转入PGEX4T-1为载体在BL21 (DE3)进行表达，USTB-05-A 基因与已经报道的sp.ACM-3962 中的 MlrA (GeneBank N0.AF411068)核酸相似性为 92.5% (Yan H., et al, Characterization of the first stepinvolved in enzymatic pathway for microcystin-RR biodegraded by Sphingopyxissp.USTB-05.Chemosphere.2012, 87，12-18)。但是目前这些实验是在混合酶液的条件下进行的，没有得到纯酶，酶的表达量和表达活性都不高，影响了藻毒素降解酶的进一步应用。因此如何获得高纯高效的藻毒素降解酶，是我们应用生物酶有效、安全解除藻毒素对水体污染的一个重要前提和首要问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种获得高纯高效的藻毒素降解酶(MlrA)的生物合成方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现: 一种获得高纯高效的藻毒素降解酶(MlrA)的生物合成方法，包括如下步骤: Cl)将如SEQ ID N0.1所示的MlrA序列构建到原核表达载体pMAL_C2X上得到表达MlrA 的载体 pMAL-MlrA。(2)将PMAL-MlrA转化到大肠杆菌TBl中得到MlrA的表达菌。(3)将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用PMAL-C2X上的融合蛋白表达标签(麦芽糖结合蛋白MBP，相对分子量42500)纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。步骤(1)中所述的载体pMAL-MlrA优选通过如下步骤的方法的制备:将如SEQ IDN0.1所示的MlrA通过合成载入克隆载体pUC19中，获得pUC19_MlrA ；以pUC19_MlrA为模板，用MlrA上游引物和下游引物扩增MlrA ;通过上下游引物上的酶切位点BamH I和HindIII将MlrA构建到pMAL-C2X载体上，得到表达MlrA的载体pMAL-MlrA ； 其中，MlrA 上游引物为 5’ -GCGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAG-3’，MlrA 下游引物为 5’-CGCAAGCTTTCACGCGTTCGCGCCGGACTT-3，。步骤(3)中所述的诱导条件优选为:诱导前菌液0D600为1.0, IPTG浓度为0.5mM,诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。步骤(3)中所述的纯化的方法优选包括如下步骤:用二次蒸馏水、0.5M的NaOH溶液、柱平衡缓冲液洗涤MBP柱，平衡纯化柱(MBP柱的再生)；将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清，与平衡本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将如SEQ?ID?NO.1所示的MlrA序列构建到原核表达载体pMAL?C2X上得到表达MlrA的载体pMAL?MlrA；（2）将pMAL?MlrA转化到大肠杆菌TB1中得到MlrA的表达菌；（3）将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用pMAL?C2X上的融合蛋白表达标签纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：冯玲玲，万坚，李俊，吴迪，苏佳丽，任彦亮，肖闪，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。