增强β-环糊精葡萄糖基转移酶(简称β-CGT酶)产β-环糊精能力的突变方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术采用定点突变方法提高一种CGT酶的产β-环糊精能力，提供了增强来源于Bacillus?circulans?STB01的β-CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶中第31位丙氨酸突变为精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或苏氨酸(Thr)，获得突变体A31R、A31P和A31T。相比于野生CGT酶，突变体产β-环糊精的能力明显增强，更适合β-环糊精的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】增强β-环糊精葡萄糖基转移酶(简称β-CGT酶)产β-环糊精能力的突变方法，属于基因工程和酶工程领域。本专利技术采用定点突变方法提高一种CGT酶的产β-环糊精能力，提供了增强来源于Bacillus?circulans?STB01的β-CGT酶产β-环糊精能力的突变方案，将CGT酶中第31位丙氨酸突变为精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或苏氨酸(Thr)，获得突变体A31R、A31P和A31T。相比于野生CGT酶，突变体产β-环糊精的能力明显增强，更适合β-环糊精的工业化生产。【专利说明】增强P-环糊精葡萄糖基转移酶产环糊精能力的突变方法
增强(6-环糊精葡萄糖基转移酶产(6-环糊精能力的突变方法，本专利技术属于基因工程和酶工程领域。本专利技术是利用定点突变方法增强环糊精葡萄糖基转移酶产物特异性的技术。
技术介绍
环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过a-1，4-糖苷键连接而成，具有环状中空圆锥形结构，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的a-、(6-和Y-环糊精最为常见。由于具有外亲水、内疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉所得产物均为a-、P-和 Y-环糊精的混合物，给单一类型环糊精产物的分离和纯化带来很多不便。目前，工业上分离@-环糊精的方法通常为选择性结晶或有机溶剂络合。本专利技术中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) STBOl的0-CGT 酶主要以生成(6-环糊精为主，但环化产物中a-和Y-环糊精仍占有较大比例，因此，进一步提高该酶产3 -环糊精的能力，将更加有利于(6-环糊精的工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供进一步提高B.circulans STB01CGT酶产0 -环糊精能力的突变方案。本专利技术的另一个目的是提出增强P -CGT酶产P -环糊精能力的突变体A31R、A31P 和A31T，及其构建方法。本专利技术的技术方案:`来源于B.circulans STBOl的CGT酶的三种突变体A31R、A31P和A31T，将CGT酶中第31位丙氨酸分别突变成精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或苏氨酸(Thr)，它们相比于野生型CGT酶具有更高的产P -环糊精能力。所述的三种突变体A31R、A31P和A31T的制备方法，根据B.circulans STBOICGT 酶的基因序列，分别设计并合成引入Arg31、Pro31和Thr31密码子的突变引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出Ala31密码子变成Arg31密码子，Pro31密码子及 Thr31密码子的突变基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。(I)定点突变利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。引入Arg31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCCGCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’-GGATTGTTGCGGGGATTGCCGTC-3?,下划线为突变碱基；引入Pix)31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCCCCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’-GGATTGTTGGGGGGATTGCCGTC-3?,下划线为突变碱基；引入Thr31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCACCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGATTGTTGGTGGGATTGCCGTC-3，，下划线为突变碱基。PCR 反应体系均为:5 XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) IOii L，dNTPs (各2.5mM)4ii L，正向引物(10 y M) I y L，反向引物(10 y M) I y L,模板 DNAl y L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/ u L) 0.5 u L,加入双蒸水 32.5 u L0PCR反应扩增条件均为:PCR扩增条件均为:98°C预变性4min ;随后98 °C 10s， 55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。将PCR产物经过DpnI消化2h后，转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。将突变质粒转入表达宿主B.subtilis WB600感受态细胞 中。各培养基中均添加g/mL硫酸卡那霉素和IOii g/mL赤霉素。(2)突变体的表达与纯化挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于LB培养基中，在37°C、 200r/min下培养8~12h，以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、1000Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体A31R、A31P和A31T酶制品。各培养基中添加5 u g/mL卡那霉素和10 u g/mL赤霉素。本专利技术的有益效果:构建了三个有意义的突变体A31R、A31P和A31T，均实现了 ^ -环糊精产物特异性的提高，比野生型CGT酶更利于P -环糊精的工业化生产。【专利附图】【附图说明】图1野生CGT酶及其突变体在pH6.0、50°C下作用于5% (湿基，w/v)麦芽糊精生产环糊精情况。A，野生CGT酶；B，突变体A31R;C，突变体A31P ;D，突变体A31T ;，a-环糊精；籲，(6-环糊精；▲，Y-环糊精【具体实施方式】实施例1:本例说明突变体A31R、A31P和A31T的制备。(I)定点突变利用快速PCR技术，以含野生CGT 酶基因的表达载体pST/cgt为模板进行定点突变。引入Arg31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCCGCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGATTGTTGCGGGGATTGCCGTC-3，，下划线为突变碱基；引入Pro31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCCCCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGATTGTTGGGGGGATTGCCGTC-3，，下划线为突变碱基；引入Thr31密码子的定点突变引物:正向引物:5’ -GACGGCAATCCCACCAACAATCC-3 ’，下划线为突变碱基，反向引物:5’ -GGATTGTTGGTGGGATTGCCGTC-3，，下划线为突变碱基。PCR 反应体系均为:5XPrimeSTAR Buffer(Mg2+Plus) IOii L，dNTPs (各2.5mM)4ii L，正向引物(10 y M) I y L，反向引物(10 y M) I y L,模板 DNAl y L，P本文档来自技高网...
【技术保护点】
来源于环状芽孢杆菌(Bacillus?circulans)STB01的环糊精葡萄糖基转移酶，简称CGT酶，的三种突变体A31R、A31P和A31T，其特征是：将CGT酶中第31位丙氨酸(Ala)分别用精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)或苏氨酸(Thr)进行取代，分别命名为A31R、A31P和A31T；相比于野生CGT酶，突变体A31R、A31P和A31T具有更高的产β?环糊精的能力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：顾正彪，李兆丰，班宵逢，程力，洪雁，李才明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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