本发明专利技术公开了一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用。该重组H5N1亚型流感病毒的基因组由如下a）和b）的8个RNA片段组成：a）与野生型H5N1亚型流感病毒基因组相同的7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1和NS2蛋白的RNA片段8；b）在野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’-非编码区前插入含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段后得到的RNA片段6’。本发明专利技术可通过观察绿色荧光阳性细胞数和荧光强度，快速对重组病毒进行定量检测，省了常规滴定的繁琐程序，为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评价提供便捷有效工具。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用。该重组H5N1亚型流感病毒的基因组由如下a）和b）的8个RNA片段组成：a）与野生型H5N1亚型流感病毒基因组相同的7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1和NS2蛋白的RNA片段8；b）在野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’-非编码区前插入含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段后得到的RNA片段6’。本专利技术可通过观察绿色荧光阳性细胞数和荧光强度，快速对重组病毒进行定量检测，省了常规滴定的繁琐程序，为抗H5N1亚型流感病毒药物筛选和疫苗评价提供便捷有效工具。【专利说明】一种重组增强型绿色荧光蛋白H5N1亚型流感病毒及其应用
本专利技术涉及一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用，特别涉及一种以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒及其应用。
技术介绍
H5N1亚型流感病毒是甲型流感病毒的一种，主要在禽类传播。近年来，H5N1亚型流感病毒感染人类的报道逐年增多，截至2012年8月，全球已有15个国家和地区报告608人感染，其中359人死亡，死亡率高达59%。感染滴度是病毒相关基础研究以及药物、疫苗研发所需的基础数据。目前H5N1亚型流感病毒的感染滴度主要依靠测定病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50)或空斑形成单位(PFU)来确定，操作复杂且准确程度易受到主观经验影响。绿色突光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,是由下村修等人在1962年从一种水母中发现的、在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光的蛋白。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是对GFP上几个氨基酸进行修改后获得的发光效率更强的绿色荧光蛋白。GFP或EGFP的荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比突光素(fluorescein)强，特别在450~490nm蓝光波长下更稳定。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。目前，尚未有以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组H5N1亚型流感病毒及其应用。本专利技术所提供的重组H5N1亚型流感病毒是以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组H5N1亚型流感病毒，其基因组RNA由如下(a)和(b)中所述的8个独立的RNA片段组成:(a)与野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA相同的如下7个RNA片段:编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PBl蛋白和PB1-F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码Ml蛋白和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NSl蛋白和NS2蛋白的RNA片段8 ;(b)与所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA不同的如下RNA片段:在所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’ -非编码区前插入RNA片段A得到RNA片段6’ ；所述RNA片段A为含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段。其中，所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；在本专利技术中，所述绿色荧光蛋白的编码RNA具体为序列表中序列9的第1434-2157位；进一步，所述RNA片段A自上游到下游依次为:猪捷申病毒(porcineteschovirus - 1，PTV-1)的2A肽序列的编码RNA、增强型绿色荧光蛋白的编码RNA ;所述RNA片段A的序列具体为序列表中序列9的第1368-2157位(序列9的1368-1433位为“2A肽”的编码RNA)。相应的，所述RNA片段6’自上游到下游依序为:所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的3’非编码区，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的编码区,所述猪捷申病毒(porcine teschovirus -1,PTV-1)的2A肽序列的编码R NA，所述增强型绿色荧光蛋白的编码RNA，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’包装信号，所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’非编码区。在本专利技术中，所述野生型H5N1亚型流感病毒具体为H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004(简称 VNl 194)毒株。具体的，在所述H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004毒株的基因组中，所述RNA片段I的序列为序列表中序列1，所述RNA片段2的序列为序列表中序列2，所述RNA片段3的序列为序列表中序列3，所述RNA片段4的序列为序列表中序列4，所述RNA片段5的序列为序列表中序列5，所述RNA片段6的序列为序列表中序列6，所述RNA片段7的序列为序列表中序列7，所述RNA片段8的序列为序列表中序列8。所述RNA片段6的5’ -非编码区序列具体为序列6的第1371-1399位。更加具体的，在本专利技术中，在所述重组H5N1亚型流感病毒基因组RNA中，所述RNA片段6’的序列具体为序列表中序列9。序列1-序列9为RNA序列。序列I共由2341个核糖核苷酸组成；序列2共由2340个核糖核苷酸组成；序列3共由2233个核糖核苷酸组成；序列4共由1779个核糖核苷酸组成；序列5共由1565个核糖核苷酸组成；序列6共由1399个核糖核苷酸组成；序列7共由1028个核糖核苷酸组成；序列8共由876个核糖核苷酸组成；序列9共由2343个核糖核苷酸组成。序列10共由263个氨基酸组成。对于序列9，第1-20位为3’ -非编码区序列，第21-1367位为NA蛋白的编码RNA序列，第1368-1433位为猪捷申病毒(porcine teschovirus -1, PTV-1)的2A肽序列的编码RNA序列，第1434-2157位为EGFP的编码RNA序列(第1434-1440位的“CGCCACC”起到增强表达的作用，EGFP真实的编码是以其后的第一个ATG开始的)，第2158-2311位为5’包装信号，第2312-2343位为5’ -非编码区序列。本专利技术的另一个目的是提供一种制备所述重组H5N1亚型流感病毒的方法。本专利技术所提供的制备所述重组H5N1亚型流感病毒的方法，可包括如下步骤:(I)将所述RNA片段1、所述RNA片段2、所述RNA片段3、所述RNA片段4、所述RNA片段5、所述RNA片段6’、所述RNA片段7和所述RNA片段8，共8个RNA片段的cDNA序列分别克隆到本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组H5N1亚型流感病毒，其特征在于：所述重组H5N1亚型流感病毒的基因组RNA由如下（a）和（b）中所述的8个独立的RNA片段组成：（a）与野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA相同的如下7个RNA片段：编码PB2蛋白的RNA片段1、编码PB1蛋白和PB1?F2蛋白的RNA片段2、编码PA蛋白的RNA片段3、编码HA蛋白的RNA片段4、编码NP蛋白的RNA片段5、编码M1蛋白和M2蛋白的RNA片段7，以及编码NS1蛋白和NS2蛋白的RNA片段8；（b）在所述野生型H5N1亚型流感病毒基因组RNA中编码NA蛋白的RNA片段6的5’?非编码区序列前插入RNA片段A后得到的RNA片段6’；所述RNA片段A为含有绿色荧光蛋白编码RNA的RNA片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李靖，户义，杨银辉，祝庆余，秦成峰，孙伟，康晓平，吴晓燕，韩鹏飞，张雨，李裕昌，李佳明，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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