一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，属于水产品技术领域。本发明专利技术方法的步骤是先把活鱼放入装有新鲜清水的周转箱内静置1～2h；快速采取活鱼背侧肌；将鱼肉丁用冰水冲洗；再用缓冲溶液漂洗；最后制得肌球蛋白溶液。本发明专利技术在提取家鱼背侧肌肌球蛋白时通过消除组织蛋白酶L的影响，获得较高纯度的鱼肉肌球蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，属于水产品
。本专利技术方法的步骤是先把活鱼放入装有新鲜清水的周转箱内静置1～2h；快速采取活鱼背侧肌；将鱼肉丁用冰水冲洗；再用缓冲溶液漂洗；最后制得肌球蛋白溶液。本专利技术在提取家鱼背侧肌肌球蛋白时通过消除组织蛋白酶L的影响，获得较高纯度的鱼肉肌球蛋白。【专利说明】
本专利技术涉及，尤其涉及一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时消除组织蛋白酶L影响的方法，属于水产品
。
技术介绍
肌球蛋白是鱼肉中含量最高也是食品加工中最重要的蛋白质，约占鱼肉总蛋白质的三分之一，占肌原纤维蛋白的55%~60%。肌球蛋白可形成具有立体网络结构的热诱导凝胶和高压诱导凝胶。肌球蛋白形成热诱导凝胶是非常重要的工艺特性，直接影响鱼糜类制品的质地、保水性和感官品质等。溶酶体中存在多种组织蛋白酶，目前已从鱼贝类肌肉和内脏中纯化并鉴定出10种组织蛋白酶，即组织蛋白酶A、B、C、D、E、H、L、L-1ike及X。溶酶体组织蛋白酶L属于木瓜蛋白酶超家族，具有内肽酶活，是溶酶体型半胱氨酸蛋白内肽酶。鱼肉肌肉内源组织蛋白酶L活性高，组织蛋白酶L的性质与鱼糜制品品质密切相关，组织蛋白酶L分子质量24ku，最适于在pH3.0~6.5环境下降解肌球蛋白。有的组织蛋白酶与肌原纤维紧密结合，仅漂洗难以洗脱鱼肉组织蛋白酶L，而其他组织蛋白酶可以从肌原纤维蛋白上洗脱下来。低PH值范围内发生的蛋白质自溶主要是由组织蛋白酶L引起的，导致凝胶形成能力差，直接影响鱼糜品质。目前提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时的前处理通常是将鱼肉直接采肉、切丁、于冰水溶液中漂洗，再进行匀浆、提取肌球蛋白。而组织蛋白酶L主要存在于鱼肉的肝脏、溶酶体和血液中，低pH值和高温会促进溶酶体的破裂，而使溶酶体中的组织蛋白酶L释放出来，与肌球蛋白接触并使其降解。提取肌球蛋白时通常是直接采肉，就可以避免肝脏中组织蛋白酶L对肌球蛋白的影响，根据弱碱性和低温协同作用使溶酶体稳定来减少组织蛋白酶L的活性；对于血液中的组织蛋白酶L，`通过快速漂洗鱼肉来减少组织蛋白酶L的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，使用该方法可以有效减小提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白时组织蛋白酶L的活性，提高肌球蛋白的浓度。本专利技术解决其技术问题所采用的方法包括如下步骤: (O活鱼放入周转箱内静置I~2 h，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气； (2)将活鱼放在工作台上，从活鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌，马上将采好的背侧肌置于冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10~20s，随即将鱼块捞出切成I~5cmXl~5cmX I~5cm鱼肉丁,此步骤时间控制在I min之内； (3)将鱼肉丁置于干净滤网上,马上用冰水比w/v=l:5的冰水冲洗I~1.5 min ； (4)鱼肉丁于5~8倍、温度为O~4°C、pH值为7.2~7.6、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10~20 min ；(5)将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的缓冲溶液A中漂洗20min, 1000Xg离心5-15min ;取出沉淀，放在沉淀5倍体积的缓冲溶液B中悬浮，加ATP至终浓度为IOmmol/L，2-6°C下放置0.5-1.5h, 15000Xg离心5-15 min ;上清液用5倍体积IMmol KHCO3溶液稀释，放置10-20min，12000Xg离心5_15min ;沉淀于5倍体积缓冲溶液C中匀浆，放置5-15min ;再用3倍体积lmmol/LKHC03溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为10mmol/L, 2_6°C下放置8-12h ;25000Xg离心15-25min ;沉淀物用2倍体积的缓冲溶液C溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2-6°C温度下； (6)测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度。所述步骤(5)中缓冲溶液A为0.1M KClUmM PMSF和0.02% NaNj^20mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5。所述步骤(5)中缓冲溶液B为0.45M KCl、5mM β _巯基乙醇、0.2 M醋酸镁、ImM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为6.8。所述步骤(5)中缓冲溶液C为0.5M KCl、5mM β -巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液，pH为7.5。所述步骤(1)- (5)的环境温度控制在10°C以下。本专利技术的有益效果: (1)将活鱼静养I~2h后再快速采肉，避免了因活鱼过分挣扎而导致机体应激反应而使溶酶体破裂，使组织蛋白酶L释放到鱼肉中，初步达到控制组织蛋白酶L活性的效果，为下一步提供了便利； (2)采肉后马上用冰水冲洗，同时时间控制在Imin之内，在溶酶体和血液释放组织蛋白酶L的同时迅速用流动水冲洗，使释放出来的组织蛋白酶L来不及与肌球蛋白结合，有效减小鱼肉中组织蛋白酶L的活性； (3)根据组织蛋白酶L的最适合pH是3.0~6.5，低pH值和高温会促进溶酶体的破裂，而pH过高会破坏肌球蛋白的结构，因此将鱼肉丁在pH值为7.2~7.6、温度为O~4°C、20mM的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗10~15 min,既有效地防止溶酶体破裂，又抑制了组织蛋白酶L的活性，进一步控制了提取鱼肉肌球蛋白时组织蛋白酶L的活性。【具体实施方式】实施例1: 一种提取鲢鱼背侧肌肌球蛋白的方法，该方法包括如下步骤: (1)活鲢鱼放入周转箱内静置Ih，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气； (2)将活鲢鱼放在工作台上，从鲢鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌100克，马上将采好的背侧肌置于1000 mL冰水比w/v =1:5的冰水中漂洗10s，随即将鱼块捞出切成2cmX 2cmX 2cm鱼肉丁,此步骤时间控制在I min之内； (3)将鱼肉丁置于干净滤网上,马上用冰水比w/v=l:5的冰水冲洗I min ； (4)鱼肉丁于5倍、温度为O~4°C、pH值为7.2、20mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液中漂洗 IOmin ； (5)将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的pH为7.5、0.1M KCl、ImM PMSF和0.02% NaN3的20mM Tris-HCl缓冲液中漂洗20 min，1000 X g离心5min ;取出沉淀，放在沉淀5倍体积的pH为6.8、0.45Μ KCl、5mM β-巯基乙醇、0.2 M醋酸镁、ImM乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸的20mM Tris-HCl缓冲液中悬浮，加ATP至终浓度为10mmol/L，2°C下放置0.5h，15000 Xg离心5min ;上清液用5倍体积IMmolKHCO3溶液稀释,放置IOmin, 12000 Xg离心5min ;沉淀于5倍体积pH为7.5,0.5M KCl、5mM β -巯基乙醇的20mM Tris-HCl缓冲液中匀浆，放置5min ;再用3倍体积1臟01/1腿0)3溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为lOmmol/L，2°C下放置8h ;25000Xg离心15min ;沉淀物用2倍体积的pH为7.5,0.5M KCl、5mM β-巯基乙醇的20mM 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取淡水鱼背侧肌肌球蛋白的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）活鱼放入周转箱内静置1～2?h，周转箱中注入干净新鲜的自来水，注水量以没过鱼体为准，并不断向周转箱中充入氧气；（2）?将活鱼放在工作台上，从活鱼头背连接处开刀快速采取背侧肌，马上将采好的背侧肌置于冰水比w/v?=1:5的冰水中漂洗10～20s，随即将鱼块捞出切成1～5cm×1～5cm×1～5cm鱼肉丁，此步骤时间控制在1?min?之内；（3）?将鱼肉丁置于干净滤网上，马上用冰水比w/v=1:5的冰水冲洗1～1.5?min；（4）?鱼肉丁于5～8倍、温度为0～4℃、pH值为7.2～7.6、20mmol/L的Tris?HCl缓冲溶液中漂洗10～20?min；（5）将鱼肉丁组织捣碎，放在10倍体积的缓冲溶液?A中漂洗20?min，1000×g离心5?15min；取出沉淀，放在沉淀5倍体积的缓冲溶液?B中悬浮，加ATP至终浓度为10mmol/L，2?6℃下放置0.5?1.5h，15000×g离心5?15?min；上清液用5倍体积1Mmol?KHCO3溶液稀释，放置10?20min,12000×g?离心5?15min；沉淀于5倍体积缓冲溶液?C中匀浆，放置5?15min；再用3倍体积1mmol/LKHCO3溶液稀释，添加无水MgCl2至浓度为10mmol/L，2?6℃下放置8?12h；25000×g离心15?25min；沉淀物用2倍体积的缓冲溶液?C溶解，得到肌球蛋白溶液；制备好的肌球蛋白溶液置于2?6℃温度下；（6）测定肌球蛋白溶液组织蛋白酶L的活性和肌球蛋白溶液的浓度。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭增起，李君珂，徐萌，张雅玮，王复龙，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：