人源化M-CSF小鼠制造技术

本发明专利技术提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠。还提供了已经用人细胞诸如人造血细胞嫁接的包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠及用于生成此类嫁接小鼠的方法。这些小鼠在许多应用中得到使用，诸如在为人免疫性疾病和病原体感染建模中；在调控（例如在健康或患病状态中）造血细胞发育和/或活性的药剂的体内筛选中；在对造血细胞有毒性的药剂的体内筛选中；在针对毒性制剂对造血细胞的毒性影响提供保护、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞的毒性影响的药剂的体内筛选中；在预测个体对疾病疗法的响应的来自个体的人造血细胞的体内筛选中，等等。

Humanized M-CSF mice

The present invention provides genetically modified mice comprising nucleic acid sequences encoding human M-CSF proteins. Genetically modified mice that have been grafted with human cells such as human hematopoietic cells, including nucleic acid sequences encoding human M-CSF proteins, and methods for producing such grafted mice are also provided. These mice are used in many applications, such as in modeling of human autoimmune diseases and pathogens; in the regulation (e.g. in healthy or diseased state) in vivo screening reagents of hematopoietic cell development and / or activity in screening chemicals are toxic to; in hematopoietic cells in vivo; in effect for toxicity the toxicity of preparation on hematopoietic cells in vivo, to provide protection, reduce the impact of screening chemicals or reverse the toxicity of the preparation for hematopoietic cell toxicity in response to individual prediction in screening; therapy of diseases from individual artificial blood cells in vivo, and so on.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人源化M-CSF小鼠专利
本专利技术涉及包含编码人M-CSF蛋白的基因的经遗传修饰的小鼠，和包含支持人造血细胞嫁接的别的修饰的小鼠。专利技术背景 研究人类疾病的动物模型的开发已经显著推进对几种疾病(包括癌症)的根本机制的了解。至今，已经证明了动物模型，特别是小鼠是用于评估药物和疗法选项的效率和效力的卓越候选物。虽然利用这些替代模型研究人生物学和疾病可以很大程度上证明是正当的(由于对进行人类实验疗法的伦理学和技术约束所致)，但是研究已经突出显示将数据从小鼠推断到人的潜在限制(Mestas J, Hughes CC.(2004) Of mice and notmen:differences between mouse and human immunology.J Immunol.172:2731-2738)。为了克服这些问题，对开发人源化小鼠模型具有长期存在的兴趣。几个小组的密集工作已经成功证明在小鼠中研究人生物学和疾病的可行性。由于在接受体中具有功能性且有效的免疫系统会导致消除人起源的移植组织/细胞，使用缺乏适应性免疫系统的细胞诸如T、B和NK细胞的遗传突变体已经显著促成人源化小鼠模型的成功。因而，人源化小鼠模型的最有效候选物包括缺乏基因的NOD-SCID和Balb/c品系，所述基因包括重组活化基因(RAG)、常见的Y链(Y C,又称为“白介素2受体，Y”,或IL2rg)、β2微珠蛋白(Β2Μ)和穿孔蛋白(Perforin) I (Prfl) (Shultz LD 等(2007)Humanized mice intranslational biomedical research, Nat.Rev.1mmunol.7:118-130)。在过去几十年里的几项研究已经证明将几类人组织，包括外周血白细胞、胎儿肝细胞、胎儿骨、胎儿胸腺、胎儿淋巴结、血管化的皮肤、动脉段和移动的或脐带血造血干细胞(HSC)移植到某些人源化小鼠中的可行性(Macchiarini F.等(2005)Humanized mice:are we there yet?J.Exp.Med.202:1307-1311)。认为此办法提供更好的模型系统，因为从这些小鼠中的人细胞获得的数据可以反映人系统的生理学。该领域中的主要调查途径是生成具有人起源的完整造血系统和功能性免疫系统的小鼠。虽然在生成具有人T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和树突细胞(DC)的免疫受损的小鼠中已经做出重大进展，但是该领域中仍有几项挑战，其中之一是人源化小鼠中较差的髓样分化。令人感兴趣地，在人源化小鼠中自造血干细胞(HSC)生成人T细胞、B细胞、NK细胞和树突细胞(DC)方面已经有很多进展。在个别造血区室外，这些小鼠中人HSC的注射导致淋巴样器官诸如胸腺和脾的重建。不过，髓样细胞，特别是粒细胞、巨噬细胞、红细胞和巨核细胞的频率是非常低的，即可能是由于这些小鼠中自人HSC的效率低的骨髓组织生成所致的结果(Shultz等(2007) ;Macchiarini等(2005))。考虑到如下的实情，即髓样起源的细胞(诸如红细胞和巨核细胞)对于血液系统的正常运行是至关重要的，以及粒细胞和巨噬细胞对于适应性免疫系统的形成是重要的，生成具有有效的人骨髓组织生成的人源化小鼠具有极为重要的意义。因而，本领域中需要在用人HSC嫁接后能够改善人骨髓组织生成的经遗传修饰的小鼠(Manz MG.Human-hemato-lymphoid-system mice:opportunities and challenges.1mmunity.2007May;26(5):537-41)。专利技术概述本申请提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠。还提供了已经用人细胞诸如人造血细胞嫁接的包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠及用于生成此类嫁接小鼠的方法。这些小鼠可用于许多应用，诸如在为人免疫性疾病和病原体感染建模中；在调控(例如在健康或患病状态下)造血细胞发育和/或活性的药剂的体内筛选中；在对造血细胞有毒性的药剂的体内筛选中；在针对毒性制剂对造血细胞的毒性影响提供保护、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞的毒性影响的药剂的体内筛选中；在预测个体对疾病疗法的响应性的来自个体的人造血细胞的体内筛选中，等等。在本专利技术的一些方面，提供了人源化M-CSF小鼠，其中所述人源化M-CSF小鼠包含核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白，并且与小鼠M-CSF结构基因基因座5’的调节序列，例如小鼠M-CSF启动子、5’ UTR等可操作连接。在一些实施方案中，所述小鼠包含两个拷贝的所述核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列位于小鼠M-CSF基因座内的小鼠基因组中。在一些实施方案中，核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接，即，小鼠是M-CSFivm小鼠。在一些实施方案中，小鼠包含两个等位基因，其中核酸序列位于小鼠M-CSF基因座内的小鼠基因组中。在一些实施方案中，这两个等位基因的核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接，即小鼠是M-CSFivh小鼠。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含至少一个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含这两个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变(nullmutation)。在一些此类实施方案中，所述无效突变是小鼠M-CSF外显子2_9的缺失。在一些实施方案中，小鼠在骨髓、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸、和肾中表达人M-CSF。在一些实施方案中，表达的人M-CSF量与野生型小鼠中表达的小鼠M-CSF量是基本上相同的。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠的骨髓间充质基质细胞表达的人M-CSF量与由野生型小鼠骨髓间充质基质细胞表达的小鼠M-CSF量是基本上相同的。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠在血液和/或组织中展现出生理学浓度的M-CSF。在一些实施方案中，小鼠表达小鼠M-CSF和人M-CSF两者。在其它实施方案中，由小鼠表达的唯一 M-CSF是人M-CSF。在一些实施方案中，小鼠分泌足够的人M-CSF以将嫁接的人造血干细胞分化成人单核细胞、人巨噬细胞、和人破骨细胞。在一些实施方案中，小鼠分泌有效量的M-CSF以刺激从源自将人造血干细胞嫁接到小鼠中的人单核细胞形成人巨噬细胞。在一些实施方案中，小鼠分泌有效量的M-CSF以在用人造血干细胞嫁接的小鼠中刺激人造血干细胞形成原单核细胞、原单核细胞形成人幼单核细胞、人幼单核细胞形成人单核细胞、以及人单核细胞形成人巨噬细胞。在一些实施方案中，小鼠中分泌的人M-CSF的有效量是为了实现相应的结果由野生型小鼠分泌的小鼠M-CSF的基本上相同量(例如，为了刺激从小鼠单核细胞形成小鼠巨噬细胞的小鼠M-CSF的有效量)。在一些实施方案中，经遗传修饰的小鼠中的人M-CSF的转录和翻译控制与缺乏其内源小鼠M-CSF基因修饰的小鼠中的小鼠M-CSF的转录和翻译控制是相同或基本上相同的。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠中人M-CSF的生理学浓度源自从在野生型小鼠中分泌小鼠M-CSF的相同细胞类型分泌人M-CSF，所述野生型小鼠具有小鼠M-CSF基因，而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人源化M?CSF小鼠，其包含：核酸序列，该核酸序列编码人M?CSF蛋白，并且与小鼠M?CSF基因的启动子可操作连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.02.15 US 61/442,9461.一种人源化M-CSF小鼠，其包含: 核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白，并且与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接。2.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含两个拷贝的所述核酸序列。3.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接。4.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含在至少一个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变。5.依照权利要求4的人源化M-CSF小鼠，其中所述无效突变是小鼠M-CSF外显子2_9的缺失。6.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠就Rag2而言是纯合无效的。7.依照权利要求6的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠就IL2rg而言是纯合无效的。8.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含人细胞。9.依照权利要求8的人源化M-CSF小鼠，其中所述人细胞是造血细胞。10.依照权利要求9的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含人病原体的感染。11.一种人造血系统的小鼠模型，其包含: Rag2中的2处无效突变； IL2rg中的2处无效突变； 与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白；和 人造血细胞。12.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接。13.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述小鼠包含小鼠M-CSF的无效缺失。14.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述小鼠展现出选自下组的一项或多项特征: a.以与野生型小鼠中的小鼠M-CSF表达相当的水平在骨髓、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸和肾中表达人M-CSF ； b.展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的h⑶14+⑶33+高2至6倍的脾h⑶14+⑶33+细胞频率； c.展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的hCD14+CD33+高2至8倍的外周血hCD14+CD33+细胞频率； d.展现出约15%至约40%的血液中h⑶14+⑶3...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·J·墨菲，S·史蒂文斯，C·雷西南，E·艾农，M·曼茨，R·弗拉维尔，G·D·雅克波罗斯，
申请(专利权)人：再生元制药公司，耶鲁大学，生物医学研究院，
类型：
国别省市：