下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途制造技术

本发明专利技术涉及能够下调锌指蛋白A20的siRNA分子，以及所述siRNA分子用于下调锌指蛋白A20、促进树突状细胞成熟和用于制备治疗急性髓性白血病的药物中的用途。本发明专利技术还涉及锌指蛋白A20的表达下调或沉默后得到的树突状细胞，所述树突状细胞优选为AML肿瘤细胞诱导产生的树突状细胞（AML-DC）；本发明专利技术还涉及所述树突状细胞用于激活CTL和/或T细胞，以及用于制备治疗急性髓性白血病的药物中的用途。本发明专利技术建立了一种增强DC疫苗抗AML免疫应答的新方法，为AML的免疫治疗开辟了一个新方向。

A20 for reducing the expression of zinc finger protein siRNA and uses thereof

The present invention relates to a zinc finger protein siRNA can down regulate A20, for reduction of zinc finger protein A20 and promote the maturation of dendritic cells and for the preparation of a medicament for the treatment of acute myeloid leukemia and in the siRNA molecule. The invention also relates to a zinc finger protein A20 expression down-regulation or silencing by dendritic cells, the dendritic cells preferably AML tumor cells induced by dendritic cells (AML-DC); the invention also relates to the use of dendritic cells to activate CTL and / or T cells, as well as for the preparation of a medicament for treating acute myelogenous in leukemia. The invention establishes a new method for enhancing the anti AML immune response of the DC vaccine, and opens a new direction for the immunotherapy of the AML vaccine.

【技术实现步骤摘要】
下调锌指蛋白A20表达的siRNA及其用途
本专利技术涉及小干扰RNA分子及其用途，特别是能够下调锌指蛋白A20的小干扰RNA（siRNA）分子，以及所述siRNA分子用于下调锌指蛋白A20、促进树突状细胞成熟和用于制备治疗急性髓性白血病的免疫细胞或药物的用途。
技术介绍
急性髓性白血病（Acutemyeloidleukemia，AML）是一类我国常见且预后很差的恶性血液病肿瘤，目前仍有大量病人对常规治疗（化疗，造血干细胞移植，生物靶向治疗等）不敏感或治疗后复发，其中白血病微小残留病灶（Minimalresidualdisease，MRD）是治疗复发的主要障碍［1-2］。近年来，肿瘤的细胞免疫治疗已经成为继手术、放疗、化疗后的第四种肿瘤治疗模式，并以安全有效，副作用小等优点逐渐被广大的医务工作者和患者认可［3］。目前认为AML病人在化疗或者造血干细胞移植治疗后，辅以特异的个体化生物免疫治疗，有利于抑制或者消除残留白血病（MRD），延缓复发，取得良好的预后［4］。在AML细胞生物免疫治疗中，以树突状细胞（Dendriticcell，DC）递呈肿瘤抗原诱导机体特异性抗肿瘤免疫的肿瘤生物治疗已成为目前临床试验研究的热点。树突状细胞(Dendriticcell,DC)是人体内功能最强大的抗原递呈细胞，具有摄取、加工抗原，以MHCⅠ、Ⅱ类肽结合物的形式递呈抗原并促进T、B淋巴细胞增殖的能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。随着对DC摄取、递呈抗原机理的不断认识，DC培养方法的不断成熟和完善，针对肿瘤的弱免疫原性、抗原调变现象、MHC分子下调或缺失、抗原加工递呈障碍等免疫特点而设计的DC疫苗已成为该领域的热点之一。这些发展为开辟肿瘤的生物治疗新途径奠定了理论和实验基础。目前应用比较多的是DC主要来源于正常细胞，即供者正常外周血和病人治疗缓解期正常造血状态下分离的DC细胞。但是正常细胞（包括供者）来源的DC也存在诸多不足：1：来源较少，不能满足临床需要；2:制备过程中需要抗原负载步骤；3:容易引发迟发型超敏反应等问题［5-6］。有研究者发现了AML病人本身的AML肿瘤细胞也能诱导出DC样的细胞（即AML-DC），并应用于临床，因此我们进行生物免疫治疗所采用的细胞也包括AML-DC。AML-DC的发现：1998年奥地利学者Oehler在研究粒细胞分化过程中发现在较高纯度的乳铁蛋白存在的条件下，晚幼粒细胞的发育途径可以发生逆转，在GM-CSF、IL-4和TNF-α存在的条件下，颠倒粒细胞成熟路径可以产DC样细胞，具有DC细胞的形态和表型，甚至有抗原递呈能力［7］。这为我们提供了利用髓性肿瘤细胞诱导分化产生DC的机会。近些年来研究的比较成功的是CML-DC和AML-DC［8］。CML-DC成熟度较高，能有效刺激同种异体T淋巴细胞反应，并在临床中有了一定的应用［9］。通过体内扩增AML-DC，发现其表型和功能存在缺陷，并且分化不够彻底，去除诱导剂后会发生逆转，不成熟的DC会诱导免疫耐受。但是AML-DC具有来源丰富，不需要抗原负载和安全性高等优点，因此具有潜在的应用前景［10］。如何能够弥补AML-DC缺陷，使之应用于临床，应用的较多的有在培养过程中加入CD40配体，SCF，Ca2+等，但是由于AML-DC存在个体差异较大，没有一种方法能够做到简单适宜通用，如何更有效的促进DC细胞的成熟，是亟待解决的技术问题［11-13］。A20（tumornecrosisfactor,alpha-inducedprotein3,TNFAIP3）是一种具有锌指结构的泛素修饰酶，它有两个泛素编辑区(Twoubiquitin-editingdomains)：N末端去泛素化酶保护受体相互作用蛋白（RIP）免于降解；C末端泛素化连接酶促进RIP降解（A20结构见图1）［14］。这使得A20具有两种不同的生物学效应，即是否泛素化来调节许多关键分子的降解［15］。近年来的研究表明A20能够通过抑制TNF和TLR（Toll-likereceptor）这两条激活途径来影响NF-κB生物活性。其主要机制如下：⑴TNF途径：A20的C末端有7个锌指结构，至少4个锌指是抑制TNF介导的NF-κB激活所需要的；同时Dixit等认为A20的N端虽然具有去泛素化活性，但与抑制NF-κB无明显相关［16］。在TNF途径中，TNF受体相关因子2和5（TNFreceptorassociatedfactor-2/5,TRAF2/5）可以使RIP1发生多泛素化，因此招集TGF-β激活酶-1（Transforminggrowthfactor-beta-activatedkinase1，TAK1）和TAK1结合蛋白-2（TAK1-bindingprotein2，TAB2)复合物，TAK1是NF-κB激活所必需，因此RIP1的多泛素化是TNF途径的关键。Dixit及其研究小组的研究指出：A20是紧密和RIP1的去泛素化和再泛素化相关联的。A20可以通过C末端连接多个泛素分子，导致RIP1被蛋白酶体识别和降解，终止了TNF所诱导的NF-κB的激活。⑵TLR途径：Boone［17］及其研究人员设计的体外试验中，A20缺陷性巨噬细胞显示出了适应于TLR2,TLR3和TLR9配体增高的NF-κB的活性，提示A20负调控多种TLR途径。在TLR4信号通路中TRAF6（TNF受体相关因子6，包含一个RING指域，是许多泛素E3连接酶所共有的部分）和二聚体E2（也称泛素结合酶）催化生成氨基酸63(K63)-多泛素化链，此链介导TLR途径中下一个成分的激活，这个成分可能是MARKKK，比如TAK1。A20的N末端和C末端活性在此途径中可能是相互独立的产生作用。尽管在调控TLR信号中C末端泛素连接酶活性尚未得到评价，但是Boone及其研究小组的确指出了N末端有去泛素化酶，可以去泛素化TRAF6，减弱或者终止TLR诱导的NF-κB的活化。另外，IKKγ是抑制性κB激酶（InhibitoryκBkinase，IKK）复合物三个组成亚基之一，它将来自上游的NIK信号传递给IKKα和IKKβ，在使用TNF或应答过表达TNFR1时，A20可以通过锌指结构与IKKγ结合，影响它的信号传递，进而阻断了NF-κB的激活。另外有相关研究证实，A20在体内炎症反应和细胞凋亡方面也存在广泛的调控作用［18］。目前的研究结果发现，A20在DC细胞的成熟、细胞因子产生及免疫刺激方面发挥重要作用，尤其在这种抗原递呈细胞中起关键的调节作用［19］。A20沉默表达使得DCs能更好的激活CTLs和Th细胞，并抑制Treg细胞。这也提供了一种在肿瘤免疫治疗中以一种抗体特有的方式去对抗Treg所介导的抑制作用的方法［20］。A20负向调控DCs细胞的成熟和细胞因子的产生，A20沉默表达的DC能自发表现和提高共刺激分子和促炎性细胞因子的表达，在起始期提高T细胞的反应性，并且通过产生IL-6及TNF-α来抑制Treg细胞所介导的自身免疫抑制作用，增强肿瘤浸润CTL细胞和Th细胞的活性，通过产生IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）来抗拒Treg所介导的抑制作用。因此，通过研究鉴别A20作为一种抗原呈递的负向调本文档来自技高网...

【技术保护点】
下调A20表达的小干扰RNA分子，其包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链或反义链包含选自以下（1）?（5）中任一项的至少一种序列：（1）SEQ?ID?NO：27～SEQ?ID?NO：35中的任一序列或与其互补的序列；（2）与SEQ?ID?NO：27～SEQ?ID?NO：35中任一序列的同一性至少为70%的序列，优选至少80%，更优选至少84%，更优选至少89%，更优选至少94%，并具有下调A20表达的能力；（3）经过改造的选自（1）或（2）中的序列，其是在所述序列的5’方向和/或3’方向上添加有至多30个核苷酸的序列，优选至多20个，更优选至多10个，更优选至多5个，并具有下调A20表达的能力；（4）经过改造的选自（1）或（2）中的序列，其是在所述序列的基础上经一个或者几个（例如1－5个、1－10个）核苷酸的截短和/或替换，并具有下调A20表达的能力；（5）与上述（1）～（4）中任一序列对应的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.小干扰RNA分子在制备治疗白血病的药物中的用途，其中所述白血病为急性髓性白血病，其中所述小干扰RNA分子的序列如SEQIDNO:27所示。2.将锌指蛋白A20的表达下调或沉默后得到的树突状细胞在制备治疗白血病的药物中的用途，其中所述白血病为急性髓性白血病，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈虎，张晓颖，张斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院附属医院，
类型：发明
国别省市：