一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法技术

本发明专利技术提供一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，该方法的特征在于用常规的Trizol法(Invitrogen公司)提取RNA后，加入苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行抽提一次，然后转移上清液至一新管，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积1mol/L醋酸钠进行沉淀RNA，所获得的RNA使用1mL?3mol/L醋酸钠(pH＝5.2)和1mL?75％乙醇各清洗一次，最后经过干燥，用DEPC水溶解，这种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究。

Method for extracting total RNA of potato tuber by improved Trizol method

The method of total RNA extraction of potato tuber provides an improved Trizol method, this method is characterized by using traditional Trizol method (Invitrogen) after extracting RNA, adding phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) were extracted once, and then transfer the supernatant to a new tube, adding the supernatant 0.7 times the volume of isopropanol and total volume of 0.2 times the volume of 1mol/L sodium acetate precipitation RNA, obtained by RNA using 1mL? 3mol/L sodium acetate (pH = 5.2) and 1mL? 75% each ethanol cleaning time, finally dried, dissolved in DEPC water, the modified Trizol method to extract total RNA to obtain high rate of potato tuber, large quantity and good quality, high purity, can meet the requirements of reverse transcription, Northern hybridization, gene translation in vitro, cDNA library construction, rapid amplification of cDNA ends and other molecular biology research.

【技术实现步骤摘要】
—种改良Tr i zo I法提取马铃薯块茎总RNA的方法一、
本专利技术属于分子生物学领域，特别涉及一种提取马铃薯块茎RNA的方法。二、
技术介绍
马铃薯(Solaunm tuberosum L.)是世界上重要的粮食作物、工业原料和保健食品，尤其是块茎与人类的关系尤为密切，在马铃薯基因组序列测定后，研究块茎中基因的功能至关重要，而获得高纯度、高质量的RNA是进行Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究必要前提和关键。马铃薯块茎中含有大量淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物，会严重影响其总RNA提取质量，例如液氮研磨时块茎中的大量淀粉会失水成干粉状，加入变性液后干粉迅速吸水呈凝胶状，即使通过高速离心亦无法使其与液相分离，导致RNA被包裹其中而无法提取；而块茎中的多糖会使RNA沉淀难溶于水，或者溶解后成粘稠状，同时多糖可以抑制许多酶的活性；多酚类化合物在研磨后匀浆时会被释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。目前，总RNA提取方法很多，主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、Chan法、SDS法、Logeman法、苯酹法、Trizol法等。DAVID等(1998)通过采用加有尿素的裂解液和氯化锂沉淀的方 法，从马铃薯块茎周皮组织中提取到高质量的RNA;杨建文等(2006)利用改进的异硫氰酸胍法提取到高质量的马铃薯块莖RNA ;赵宝勰等(2010)分别采用Chan法和Trizol法提取马铃薯块茎总RNA，结果表明:Chan法比Trizol法更适宜提取马铃薯块茎总RNA ;刘柏林等(2012)选用3种快捷的商品化提取试剂提取马铃薯块茎总RNA，结果表明:3种商品化试剂均可不同程度的提取马铃薯块茎总RNA，但纯度和浓度存在较大差异。Trizol法自问世以来，由于其操作简单方便，耗时较短，被广泛应用于组织的RNA提取，但它对于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物马铃薯块茎效果不理想。三、
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有方法的缺点与不足，提供，该方法提取的马铃薯块茎总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度闻。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:，包含以下步骤:(I)取新鲜块茎加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入ImLTrizol试剂，充分混匀，25°C静置5min ；(2) 4°C, 12000r/min离心5min,直接倒上清入新1.5mL离心管中；(3)将步骤(2)收集的上清液中加入200 μ I氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4°C，12000r/min 离心 15min ；(4)将步骤(3)收集的上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀30min ；(5) 4°C, 12000r/min 离心 IOmin,弃上清，加入 ImL 75 % 乙醇洗沉淀，4°C, 8000r/min离心5min,弃上清，干燥；(6)将步骤(5)干燥的沉淀加入500 μ I DEPC水溶解，再加入500 μ I苯酚/氯仿/ 异戍醇(25: 24:1),颠倒混匀，4°C, 12000r/min 离心 20min ;(7)将步骤(6)收集的上清转移至新1.5mL离心管中，加入上清液0.7倍体积异丙醇和总体积0.2倍体积lmol/L醋酸钠，上下颠倒混匀；(8) _20°C沉淀 30min。4°C, 12000r/min 离心 20min,弃上清，加入 ImL 3mol/L 醋酸钠(PH = 5.2)清洗，4°C, 10000r/min 离心 5min ；(9)弃上清，用ImL 75 %乙醇洗涤沉淀，在超净工作台干燥，加入DEPC水溶解，-20°C储存备用。RNA提取中所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理。综上所述改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法适用于富含淀粉、多糖、多酚类物质以及较多次级代谢产物的植物组织的总RNA提取。本专利技术相对于 现有Trzol法，具有如下的优点及有益效果:本专利技术所述改良Trzol法提取马铃薯块茎总RNA的步骤虽然繁琐一些，时间较长一些，但是总RNA获得率高，量大，并且质量好、纯度高，可以满足反转录、Northern杂交、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增等分子生物学研究，例如利用本法提取的马铃薯块茎总RNA杂质较少，28S、18S和5S条带清晰，28S条带的亮度是18S条带的两倍左右，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的电泳效果要差一些,28S条带的亮度并不是18S条带的两倍左右，杂质较多(附图1)，通过对两种方法提取的RNA进行纯度检测，发现改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA0D26Q/0D28Q比值在1.8-2.0之间，要明显高于常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的INA样品(表1)，说明改良Trizol法提取RNA纯度较好，而常规Trizol法(Invitrogen公司)提取的RNA0D26(l/0D28(l比值低于1.8，说明有蛋白质和有机溶剂的污染，对于这4个样品的RNA0D26(i/0D23(i比值高于2，说明没有盐离子的残&3甶O表1提取RNA样品的纯度检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，其特征在于以下操作：a、取新鲜块茎约0.1g，加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入1mL?Trizol试剂，充分混匀，25℃静置5min，4℃，12000r/min离心5min，直接倒上清入新1.5mL离心管中，加入200μl氯仿，颠倒混匀，室温静置5min，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，?20℃沉淀30min；b、4℃，12000r/min离心10min，弃上清，加入1mL?75％乙醇洗沉淀，4℃，8000r/min离心5min，弃上清，加入500μl?DEPC水溶解沉淀，再加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，颠倒混匀，4℃，12000r/min离心20min；c、吸取上清至新1.5mL离心管中，加入0.7倍体积异丙醇和0.2倍体积1mol/L醋酸钠，上下颠倒混匀，?20℃沉淀30min，4℃，12000r/min离心20min，弃上清，加入1mL?3mol/L醋酸钠(PH＝5.2)清洗，4℃，10000r/min离心5min，弃上清，75％乙醇洗沉淀；d、沉淀在超净工作台干燥，加入40μl?DEPC水溶解，储存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种改良Trizol法提取马铃薯块茎总RNA的方法，其特征在于以下操作: a、取新鲜块茎约0.lg，加液氮研磨至粉末状，迅速转移到1.5mL离心管中，加入ImLTrizol试剂,充分混匀，25°C静置5min, 4°C, 12000r/min离心5min,直接倒上清入新1.5mL离心管中，加入200 μ I氯仿,颠倒混匀，室温静置5min, 4°C, 12000r/min离心15min,吸取上清至新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀30min ； b、4°C,12000r/min 离心 IOmin,弃上清，加入 ImL 75 % 乙醇洗沉淀,4 °...

【专利技术属性】
技术研发人员：李立芹，王西瑶，王伟，杨先泉，倪苏，刘帆，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：