本发明专利技术公开了一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。本发明专利技术所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明专利技术利用以上引物，通过在反应液加入SYBR?Green?I荧光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可视化检测方法，且该方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，这对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。本专利技术所提供的引物为引物组，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本专利技术利用以上引物，通过在反应液加入SYBR?Green?I荧光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可视化检测方法，且该方法灵敏度高、特异性好、成本低、不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，这对鲑鳟鱼鱼苗的引种、无特定病原体种鱼的培育，以及鲑鳟鱼无公害健康养殖均有重要意义。【专利说明】用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用
本专利技术涉及一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的LAMP引物及应用。
技术介绍
传染性造血器官坏死病(infectioushaematopoietic necrosis, IHN)是由传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)引起的一种常见的危害鲑鳟鱼类的急性病毒性传染病。自从上世纪50年代在美国首次暴发以来，IHNV已经扩散至欧洲、澳洲、亚洲等十余个国家。IHNV可造成鲑鳟鱼鱼苗近100%的死亡率，对世界的鲑鳟鱼养殖业造成了巨大的经济损失。因此，实用、快速、灵敏、准确的IHNV检测技术的建立在IHN早期诊断、水产品卫生质量监督、疫情监测等方面具有重要的意义。目前，世界动物卫生组织推荐的IHN的几种诊断方法包括细胞培养分离方法、免疫学方法(中和试验法、间接荧光抗体法和ELISA法)和分子生物学方法(PCR法、PCR探针和序列测定法)。PCR方法是目前最常用的快速检测方法，已经有以PCR技术为依托的商业化的IHNV检测试剂盒，这些检测试剂盒需要专门的仪器或者对PCR产物进行凝胶电泳与紫外线分析才能确定检测结果。环介导等温扩增(loopmediated isothermal amplification,LAMP)技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP 则针对靶基因的6个不同区域，设计4种特异引物一内侧引物对和外侧引物对，必要时再加上环形引物对，对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组。本专利技术所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，具体可为引物组A或引物组B ;所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物I (F3)、所述引物2 (B3)、所述引物3 (FIP)、所述引物4 (BIP)、所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。所述引物组A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比可为1:1:8:8:4:4。所述引物组B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比可为1:1:8:8。在本专利技术的一个实施例中，所述引物I (F3)和所述引物2 (B3)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.2 PM;所述引物3 (FIP)和所述引物4 (BIP)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1·6μΜ;所述引物5 (Loop-F)和所述引物6 (Loop-B)在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为O. 8 μ Μ。所述引物组中，引物I (F3)和引物2 (Β3)组成外侧引物对；引物3 (FIP)和引物4 (BIP)组成内侧引物对；引物5 (Loop-F)和引物6 (Loop-B)组成环形引物对。序列I由20个核苷酸组成，序列2由20个核苷酸组成，序列3由45个核苷酸组成，序列4由46个核苷酸组成，序列5由18个核苷酸组成，序列6由20个核苷酸组成。本专利技术的又一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂。本专利技术所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂，具体可包括反转录酶、链置换型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物组。当所述引物组为所述引物组A时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：20pmol ：20pmol ：25mmol ：5nmol ： IOU ：8U0当所述引物组为所述引物组B时，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反转录酶和所述链置换型DNA聚合酶在所述扩增试剂中的配比可为 5pmol ：5pmol ：40pmol ：40pmol ：25mmol ：5nmoI ： IOU :8U。在本专利技术中，所 述反转录酶具体可为AMV反转录酶；所述链置换型DNA聚合酶具体可为Bst2. ODNA聚合酶(如NEB公司产品目录号为M0537S的产品）或Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段。在本专利技术的一个实施例中，所述试剂具体由所述AMV反转录酶、所述Bst2. ODNA聚合酶、所述dNTPs、10X等温扩增缓冲液和所述引物组组成；其中，所述IOX等温扩增缓冲液的ρΗ8· 8，溶剂为水，溶质及其浓度如下：Tris-HC120mM、KC150mM、（NH4)2SO4IOmM、MgS042mM、Tween-20 体积分数 O. 1%。所述AMV反转录酶为Promega公司产品；所述Bst2. ODNA聚合酶为New EnglandBiolabs公司产品。在实际使用过程中，上述试剂的各组分在(逆转录）环介导等温扩增反应体系中的终浓度为：所述引物I和所述引物2各0.2 μ mol/L;所述引物3和所述引物4各1.6 μ mol/L ;所述引物5和所述引物6各O. 8ymol/L ;所述dNTPslmmol/μ L ;所述AMV反转录酶O. 4U/μ L ;所述Bst2. ODNA聚合酶O. 32U/ μ L ;所述IOX等温扩增缓冲液体积分数10%。本专利技术的还一个目的是提供一种用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒。本专利技术所提供的用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增试剂盒，含有所述扩增试剂和荧光显色剂。所述荧光显色剂为荧光染料SYBR Green I (如Invitrogen公司产品）。如下a)或b)的应用也属于本专利技术的保护范围：a)所述引物组在制备所述试剂盒中的应用；b)所述引物组，或所述试剂，或所述试剂盒在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有传染性本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测传染性造血器官坏死病毒的环介导等温扩增引物组，为引物组A或引物组B；所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐黎明，卢彤岩，刘淼，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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