一种枣树抗病基因转化的方法技术

本发明专利技术涉及一种枣树抗病基因转化的方法，属于植物生物技术领域。具体步骤包括：(1)预培养受体材料；(2)制备侵染液：包括：①农杆菌菌液制备；②MS母液的制备；(3)侵染受体材料；(4)共培养；(5)抑菌及卡那霉素筛选培养；(6)分子检测。本发明专利技术采用双层培养基进行共培养，既有效保证了受体的充足营养，又克服了共培养期间因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制作用，并减轻了后期抑菌困难的问题；具有较高的可重复性，在一定程度上缩短了枣树遗传育种的周期，使木本植物宁阳大枣难于进行基因介导的难题和因受体材料原因导致的侵染效率低下问题得以改善，为进一步的遗传育种研究提供一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，属于植物生物
。具体步骤包括：(1)预培养受体材料；(2)制备侵染液：包括：①农杆菌菌液制备；②MS母液的制备；(3)侵染受体材料；(4)共培养；(5)抑菌及卡那霉素筛选培养；(6)分子检测。本专利技术采用双层培养基进行共培养，既有效保证了受体的充足营养，又克服了共培养期间因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制作用，并减轻了后期抑菌困难的问题；具有较高的可重复性，在一定程度上缩短了枣树遗传育种的周期，使木本植物宁阳大枣难于进行基因介导的难题和因受体材料原因导致的侵染效率低下问题得以改善，为进一步的遗传育种研究提供一种新的途径。【专利说明】
本专利技术涉及，属于植物生物
。
技术介绍
自古以来，枣因具有很高的营养保健和药用价值，受到人们广泛欢迎，这也使枣产业成为一些地方经济支柱产业之一，但枣疯病的蔓延却严重制约了枣产业的健康可持续发展，影响了人们对枣果的旺盛需求，限制了枣产区的经济发展步伐。1983年来，植物基因工程发展很快，但是在果树上应用的研究还很少，由于果树育种周期长，不断地摸索试验快速有效的育种方法是很有意义的。对于枣疯病的防治，多采用化学防治和物理防治等方法，但效果都难以持久。因此，利用基因工程技术，寻找一种以枣树本身为基础，从根本上解决问题的方法，提高枣树自身抵抗枣疯病病毒的能力，成为解决此问题的一种有效途径。本项技术专利技术采用的农杆菌介导的转化方法是目前应用最广的基因转化方法，具有操作简便、成本低、`转化率高的特点，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。但其也具有一定局限性，即基因介导的效率易受到很多因素的影响，如受体材料的部位、年龄、生长状态等，这就需要寻找最适合的搭配组合，最大限度地提高转化效率。在实际操作中，农杆菌介导法要求先建立较完善的植物受体系统，一般采用的植物受体材料是叶盘或愈伤组织，这样可以大大提高转化效率，但对于很多难于建立高效再生体系的木本植物的基因转化就有了很大限制。在枣树等木本植物基因转化试验中还存在基因转化困难，效率低、周期长、转化后嵌合体现象严重等问题，因此，如何解决枣树等木本植物基因转化困难并进一步提高基因转化效率成为当前一个亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术的缺陷，提供一种以枣树组培苗茎段为受体材料，以pH6.2~7.0的MS母液与农杆菌菌液的混合液为侵染液，受体转化后共培养采用双层培养基，抗生素筛选分3个阶段进行的基因转化方法，以解决木本植物枣树基因转化困难的问题。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下:，具体步骤如下:(I)预培养受体材料:选择大枣组培苗进行取材，组培苗应生长健壮，无玻璃化及枯黄现象，高度I~3cm，贴近培养基的茎基部粗度目测高于1mm，每段茎段长度为I~1.5cm，至少保留一个芽，将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面，培养基厚度I~2cm，每瓶培养基体积约15~20ml,每瓶培养基可放6~8个莖段；将嵌入培养基的莖段置于黑暗环境下暗培养2~6d,培养温度25°C左右。(2)制备侵染液:包括:①农杆菌菌液制备:挑取农杆菌菌株LBA4404(由中科院遗传所提供)的单菌落接种到5ml含有50mg / L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液体培养基中，在温度25~30°C，震荡转速160~200rpm条件下培养12~48h，然后取I~5ml转接于100ml含有50mg / L卡那霉素的YEP液体培养基中，在温度25~30°C、转速160~200rpm的条件下培养12~24h，菌液0D6000.3~0.7时作为备用菌液；@MS母液的制备:本专利技术所用MS母液为MS培养基常用量的全量MS母液，按每升培养基常规用量配制，为包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物四类溶液的混合液，母液混匀后高压灭菌备用。(3)侵染受体材料:先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按I / 3~I / 2体积比混合,将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节PH6.2~6.7，备用；再将已预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，再在无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理。刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15~20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触。(4)共培养:侵染结束，取出受体茎段，用无菌滤纸吸干表面多余液体，转接于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6~8个茎段放置。将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2~4d，培养温度23~28°C左右。对照同样处理。(5)抑菌及卡那霉素筛选培养:共培养结束，将受体材料转接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef (头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行,各阶段的培养基均调节为PH6.2~7.0。第一阶段卡那霉素20mg / L，抑菌素Cef (头孢霉素)400mg / L,培养6~IOd ;第二阶段卡那霉素40mg / L,抑菌素Cef (头孢霉素)400mg /L，培养15~20d ;第三阶段卡那霉素60mg / L，抑菌素Cef (头孢霉素)200mg / L，培养20 ~30d。(6)分子检测:经过上述两个阶段的Cef抑菌和卡那霉素筛选培养，20d后，受体茎段表现出明显分离生长状态，超过I / 3的茎段出现由黄化至枯死的变化，约2 / 3茎段萌发出绿色的抗性新芽，抗性芽长度大约0.5~1cm。对存活的抗性芽苗进行采样，提取抗性芽的DNA并进行PCR扩增检测，提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法，采用CcRIPII~2基因序列资料,设计引物:引物1:5，~TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT ~3，；引物2:5 ’ ~TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA ~3 ’。通过采用上述基因转化技术方案，以枣树组培苗茎段为受体材料，以MS母液与农杆菌菌液配伍的混合液为侵染液，受体转化后共培养采用双层培养基，抗生素筛选分3个阶段进行的基因转化方法，可以明显提高基因转化效率，经PCR初次检测，阳性条带检出率可达100%，对检出的抗性芽Kan纯化培养，连续继代6次，抗性苗检出率稳定在50%以上。本实验方案具有转化材料易得，转化过程简单易行，周期短，可重复性强的优点，为木本植物宁阳大枣在基因转化技术方面提供了新的突破。该专利技术的有益效果在于:本专利技术方案找到了适合宁阳大枣基因转化的材料部位为茎段，材料易得，只要建立快繁无菌体就可以进行基因转化试验，突破了基因转化对受体材料高效再生状态的限制；采用双层培养基进行共培养，既有效保证了受体的充足营养，又克服了共培养期间因农杆菌过度繁殖对受体材料正常生长的抑制作用，并减轻了后期抑菌困难的问题；在抑菌及卡那霉素筛选培养阶段，分别以3种筛选培养基逐步进行，改善了脱离母体瓶苗茎段的营养状况，减低和缓解了抑菌筛选药剂对受体材料的毒害作用。本专利技术方案为难于在短时间内获得高效再生体系的枣树等木本植物提供了一种简单有效的基因转化方法，具有较高的可重复性，在一定程度上缩短了枣树遗传育种的周期，使木本植物宁阳大枣难于进行基因介导的难题和因受体材料原因导致的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枣树抗病基因转化的方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：(1)预培养受体材料：选择大枣组培苗进行取材，组培苗应生长健壮，无玻璃化及枯黄现象，高度1～3cm，贴近培养基的茎基部粗度目测高于1mm，每段茎段长度为1～1.5cm，至少保留一个芽，将剪取的茎段浅嵌于分化培养基表面，培养基厚度1～2cm，每瓶培养基体积约15～20ml，每瓶培养基可放6～8个茎段；将嵌入培养基的茎段置于黑暗环境下暗培养2～6d，培养温度25℃左右；(2)制备侵染液：包括：①农杆菌菌液制备：挑取农杆菌菌株LBA4404(由中科院遗传所提供)的单菌落接种到5ml含有50mg／L卡那霉素(Kanamycin)的YEP液体培养基中，在温度25～30℃，震荡转速160～200rpm条件下培养12～48h，然后取1～5ml转接于100ml含有50mg／L卡那霉素的YEP液体培养基中，在温度25～30℃、转速160～200rpm的条件下培养12～24h，菌液OD6000.3～0.7时作为备用菌液；②MS母液的制备：本专利技术所用MS母液为MS培养基常用量的全量MS母液，按每升培养基常规用量配制，为包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物四类溶液的混合液，母液混匀后高压灭菌备用；(3)侵染受体材料：先将制备好的农杆菌菌液和MS母液按1／3～1／2体积比混合，将混合液倒入空的无菌培养瓶并调节pH6.2～6.7，备用；再将已预培养的受体材料茎段取出，置于无菌空培养皿中，立即用配制好的侵染液濡湿受体茎段，再在无菌条件下进行适当刻伤，对照材料同时进行同样刻伤处理；刻伤处理后，将受体材料转移至已盛有侵染液的培养瓶内侵染15～20min，侵染液体积以没过侵染材料为宜，侵染期间用手间歇摇动侵染瓶，以使材料与侵染液充分接触；(4)共培养：侵染结束，取出受体茎段，用无菌滤纸吸干表面多余液体，转接于表面加盖一层用MS母液润湿的无菌滤纸的双层培养基上，仍按每瓶培养基6～8个茎段放置；将封好口的培养瓶置于黑暗条件下共培养2～4d，培养温度23～28℃左右；对照组同样处理；(5)抑菌及卡那霉素筛选培养：共培养结束，将受体材料转接于含有卡那霉素(kanamycin)和抑菌素Cef(头孢霉素)的筛选培养基上继续培养，分3个阶段进行，各阶段的培养基均调节为pH6.2～7.0；第一阶段卡那霉素20mg／L，抑菌素Cef(头孢霉素)400mg／L，培养6～10d；第二阶段卡那霉素40mg／L，抑菌素Cef(头孢霉素)400mg／L，培养15～20d；第三阶段卡那霉素60mg／L，抑菌素Cef(头孢霉素)200mg／L，培养20～30d；(6)分子检测：经过上述两个阶段的Cef抑菌和卡那霉素筛选培养，20d后，受体茎段表现出明显分离生长状态，超过1／3的茎段出现由黄化至枯死的变化，约2／3茎段萌发出绿色的抗性新芽，抗性芽长度大约0.5～1cm；对存活的抗性芽苗进行采样，提取抗性芽的DNA并进行PCR扩增检测，提取转基因植株基因组DNA的方法是CTAB法，采用CcRIP?II～2基因序列资料，设计引物：引物1：5’～TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT～3’；引物2：5’～TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA～3’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯殿齐，黄艳艳，刘静，罗磊，赵进红，张虹，王玉山，
申请(专利权)人：泰安市泰山林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：