本发明专利技术属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用于猪腹泻抗性性状相关的分子标记的检测及应用。所述的分子标记由基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。在序列表SEQ?ID?NO：1的第625bp处有一个G/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-BshN1多态性。本发明专利技术还公开了扩增基因DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本发明专利技术为猪腹泻抗性性状标记辅助选择提供了新的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于家畜分子标记制备
，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用于猪腹泻抗性性状相关的分子标记的检测及应用。所述的分子标记由基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。在序列表SEQ?ID?NO：1的第625bp处有一个G/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-BshN1多态性。本专利技术还公开了扩增基因DNA序列所用的引物以及用于多态性的检测方法。本专利技术为猪腹泻抗性性状标记辅助选择提供了新的分子标记。【专利说明】一种仔猪腹泻抗性相关的分子标记检测方法及应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种包含如SEQ ID NO:1所示仔猪基因核苷酸的核酸分子。本专利技术还涉及如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
技术介绍
研究表明，GPI与生物体很多疾病有关。已知的与人沉积在老年性痴呆、感染性蛋白质疾病(包括人的 Creutzfeld-Jakob 病，Gerstmann-straussler-scheinker 综合症，库鲁病和绵羊及山羊的瘙痒症等)、类风湿关节炎、非洲昏睡病、疟疾、阵发性夜间血红蛋白尿症、慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌等有直接关系。在白念珠菌耐药基因研究中，GPII被认为与耐药有关(麻志萍等，2008)。在朊蛋白的有关研究中，GPI锚定位点的移除可减少对感染性朊蛋白疾病的易感性，保护了可溶性的PrPc转变为支持感染性朊蛋白复制的分子(张太翔，2008)。还有研究表明，缺氧状态下，YC-1抑制人胰腺癌PC-3细胞血管内皮生长因子(VEGF)和GPI基因转录与其抑制HIF-1 α蛋白的表达有关，YC-1能够抑制人胰腺癌PC-3细胞生长和增殖。同时有实验表明，在鼠的肝脏内腔隙中存在GP1-PLD，在移去肝脏以后，酶的活性明显下降，在紧接着移植入肝后，酶的活性明显增加，在严重肝疾病时，酶的活性依赖于肝的合成储备功能，说明肝是其主要来源。在病毒性肝炎及支气管炎肺炎时，其活性明显上升，说明GP1-PLD也可作为一个急性期反应物。竞争性RT-PCR监测在不同恶性程度肿瘤细胞中GP1-PLD mRNA的表达水平，发现释放大量肿瘤可溶性预后标记物的卵巢癌细胞与释放少量标记物的卵巢癌细胞相比，其GP1-PLDmRNA 的表达水平明显增加(Xiao Guang-fen，2010)。人的GPIl基因包含11个外显子，定位于16pl3.3，靠近α血红蛋白基因座，GPII基因在组织和细胞中的表达无所不在，尤其在骨髓、胎儿肝脏等造血组织中的表达显著高于其他组织。GPIl基因目前已被确认是GPI生物合成的必需组成部分。GPI编码产物与糖基磷脂酰肌醇的合成密切相关。在生物体的免疫、代谢等多个方面发挥重要的作用。可以预见，由于GPIl基因对于GPI合成的重要性，GPIl基因对于生物体的疾病有着非常重要的调控作用。而目前对猪GPIl基因的结构和功能的研究却还不太深入。本专利技术选择猪GPIl基因作为猪腹泻抗性性状的候选基因，以3个外来猪种(杜洛克猪、大白猪、长白猪)和I个本地猪种(宁乡猪)为试验材料，采用PCR-RFLP方法对GPIl基因G/T位点的基因频率、基因型频率进行检测，并分析其遗传结构，初步探讨该基因与腹泻抗性性状的相关性。目前国内外关于猪GPIl基因的相关研究很少。本专利技术将找到与仔猪腹泻抗性有关的遗传标记，为筛选ETEC F4抗性猪提供可行的标记辅助选择方法，为选育ETEC F4抗性猪配套系提供理论研究依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于找到与仔猪腹泻抗性有关的遗传标记，为筛选ETEC F4抗性猪提供可行的标记辅助选择方法，为ETEC F4抗性猪的早期选种提供依据，为选育ETEC F4抗性猪配套系提供理论研究依据。本专利技术通过以下技术方案实现:利用比较基因组学方法，根据专利技术人提交到GenBank的GPIl基因序列(收录号为JX125039)和人的GPIl基因的保守区设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序技术发现SNP，并利用PCR — RFLP进行基因分型，再利用独立性卡方检验对检测的该基因SNPs与腹泻抗性的关联度进行分析，以检验该SNPs的实际应用效果。(I)PCR引物设计与序列获得利用Primer Premier软件，根据不同物种的GPII基因的保守序列制备了检测上述序列表SEQ ID NO:1基因片段突变的引物对，所述的引物对的正向引物为5' -CTTGGAGCTAAG CAGTGATGTG-3'，反向引物为 5' -CTGAGAGGTGTGATGAGGTCTG-3'。该引物对的退火温度为62°C，以猪的基因组DNA为模板，构建20 μ L的扩增体系，经过预变性、变性一退火一延伸33个循环以及后延伸的反应过程，获得了目的片段，片段核苷酸序列如序列表SEQID NO:1所述。(2) SNP发现与检测方法建立专利技术人通过对扩增序列测序，得到了一种与仔猪腹泻抗性相关的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所述。序列表SEQ ID NO:1序列的625bp处有I个G/T的碱基突变，导致PCR-RFLP-BshNl多态性，PCR产物经BshNl酶切后，显示出GG、GT和TT二种基因型。 专利技术设计了扩增包含该 SNPs的引物，经分析G/T位点的突变可以采用BshNl进行酶切检测多态性。在扩增的809bp的片段上，存在I个BshNl的酶切位点，经2%琼脂糖凝胶电泳检测后结果显示，在GPIl基因的G/T位点存在3种基因型，GG型(809bp)、GT型(345bp、464bp、809bp)和 TT 基因型(345bp、464bp)。(3)基因型一腹泻抗性关联分析利用独立性卡方检验对基因型与腹泻性状进行关联分析，分析表明在杜洛克猪、长白猪、大白猪中T基因为优势等位基因，T基因频率分别为1，0.99,0.97，而在宁乡猪中G基因为优势等位基因，基因频率为0.85。GPIl基因的基因型分布在以这四个猪种为代表的中外猪种中差异较大，三个外来品种的仔猪的基因型分布与宁乡猪中的分布差异极显著(P < 0.01)，仔猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异显著(0.0Kp< 0.05)，尤其在大白猪、长白猪外显子的两种基因型TT型、GT型间的腹泻抗性差异极显著(P <0.01)，表明杜洛克、长白猪、大白猪TT基因型的腹泻个体非常集中，在杜洛克、长白猪、大白猪这三个品种猪中TT型将可能是腹泻抗性的参考遗传标记。利用上述制备的与猪腹泻抗性相关的分子标记对不同猪品种的腹泻情况进行了关联分析的应用，从而完成了本专利技术。【专利附图】【附图说明】图1 GPII基因SNPs位点的PCR扩增产物图2 GPII基因SNPs位点的酶切电泳结果泳道1，5，6，7，9，12:GG基因型;泳道2，3，4，11:GT基因型;泳道8，10:TT基因型；【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步地解释，但【具体实施方式】并不对本专利技术做任何限定。实施例1:1.引物设计利用比较基因组学方法根据猪的GPIl基因(GenBank收录号为JX125039)的第I外显子，以该基因在GenBank作BLA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种仔猪腹泻抗性相关的GPI1基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何俊，张珈榕，马海明，蒋隽，贺长青，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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