本发明专利技术公开了一种适配体修饰的纳米银探针，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。本发明专利技术还公开了包含上述探针的试剂盒及其在检测PDGF-BB中的应用。本发明专利技术的纳米银探针与显色剂联用能提高显色可视化检测的灵敏度，检测PDGF-BB的线性范围为1.56ng/mL-100ng/mL，检测限低，特异性好。此种纳米银探针的合成及修饰方法成熟，显色剂检测性能优良，两者的联合可以使检测PDGF-BB的灵敏度大大提高，检测过程大大简化。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种适配体修饰的纳米银探针，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链。本专利技术还公开了包含上述探针的试剂盒及其在检测PDGF-BB中的应用。本专利技术的纳米银探针与显色剂联用能提高显色可视化检测的灵敏度，检测PDGF-BB的线性范围为1.56ng/mL-100ng/mL，检测限低，特异性好。此种纳米银探针的合成及修饰方法成熟，显色剂检测性能优良，两者的联合可以使检测PDGF-BB的灵敏度大大提高，检测过程大大简化。【专利说明】适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒与在检测PDGF-BB中的应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种适配体修饰的纳米银探针及其试剂盒在检测roGF-ΒΒ中的应用。
技术介绍
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,F1DGF)是一种强效的丝裂原和重要的促肿瘤血管生成生长因子,可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生。目前对肿瘤细胞中I3DGF表达与检测的研究已成为生物医学研究领域的热点之一。适配体是具有三维空间结构能特异性识别目标蛋白质的DNA或RNA分子，合成容易，易于修饰且稳定。我们利用适配体功能化的纳米银可以实现对血小板衍生生长因子-BB(即TOGF-BB)的特异识别。纳米银具有优良的表面催化特性，当金属离子和还原剂分子吸附到其表面时，纳米银催化氧化还原反应并在其表面产生一层金属膜。基于此原理，我们合成了适配体修饰的纳米银探针，通过其催化金属沉积实现对TOGF-BB的高灵敏，特异性可视化分析检测。【
技术实现思路
】本专利技术还要解决的技术问题，是提供包含上述纳米银材料的试剂盒，用于TOGF-BB的检测。本专利技术最后要解决的技术问题，是提供上述试剂盒在检测TOGF-BB中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下:一种适配体修饰的纳米银探针，它以直径为10~30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；所述的适配体链，其核苷酸序列为:5，SH-(CH2) 6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG。所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为:5’ SH- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。上述适配体修饰的纳米银探针的制备方法，它包括如下步骤:(I)在冰浴条件下，将2-20mmol/L硝酸银溶液逐滴加入至3-30mmol/L硼氢化钠溶液中，硝酸银与硼氢化钠的反应摩尔比为1:3，不断搅拌至反应完全，然后补加硼氢化钠溶液，补加的硼氢化钠的摩尔量为上述参与反应的硼氢化钠的摩尔量的7%，继续搅拌至室温，得到纳米银溶液；(2)将适配体链和寡核苷酸链按摩尔比(I~9): (I~99)加入步骤(1)得到的纳米银溶液中，静置10~24小时，适配体链和寡核苷酸的总摩尔量与纳米银摩尔量之比为(100-1000):1 ；所述的适配体链，其核苷酸序列为:5，SH- (CH2) 6-AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG,其 5’ 端由巯基修饰；所述的寡核苷酸链，其核苷酸序列为:5’ SH-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’，其5’端由疏基修饰；(3)向步骤(2)得到的混合体系中加入I X PBS缓冲溶液，使得混合体系中的PBS缓冲溶液的浓度为0.1XPBS，静置3~10小时；(4)向步骤(3)得到的混合体系中加入I~5mol/L氯化钠溶液，静置2~4小时，重复加入氯化钠溶液与静置的步骤I~4次，使得氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L ；(5)将步骤(4)得到的混合体系静置24~72小时；(6)将步骤(5)得到的溶液经离心去除上清，取沉淀加入I X PBS缓冲溶液重悬，重复离心与重悬的步骤2~4次，IXPBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的0.1~5倍；最后离心得到的沉淀用I XPBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。步骤⑵中，适配体链和寡核苷酸链摩尔比优选为(I~10): (I~1:10)，最优选为1:1 ;静置时间优选为15~20h，最优选为18h。步骤(3)中，PBS缓冲溶液优选为I XPBS，即包含如下物质的水溶液:137mM NaCl，2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4.12H20,2mM KH2PO4 ;静置时间优选为 6h。步骤(4)中，氯化钠溶液的浓度优选为2mol/L ;氯化钠的终浓度优选为0.2mol/L ；静置时间优选为3h。步骤(5)中，静置时间优选为48h。步骤(6)中，所述的离心条件为10000~20000rpm条件下离心10~30分钟,优选15000条件下离心15分钟。所述的I XPBSM配方为I XPBS和lmmol/L MgCl20上述适配体修饰的纳米银探针在制备检测TOGF-BB的试剂中的应用。一种用于检测TOGF-BB的试剂盒，该试剂盒包含如下试剂:适配体修饰的纳米银探针、磷酸盐缓冲液、Tween-20 ,ant1-PDGF-BB抗体、PDGF-BB、氯金酸、氢醌、牛血清白蛋白、醛基片基。上述用于检测TOGF-BB的试剂盒在检测I3DGF-BB中的应用。利用上述检测TOGF-BB的试剂盒检测I3DGF-BB含量的具体方法，依次顺序包括如下步骤:(I)配制溶液:稀释液:将20 X PBS用二次水稀释20倍至IXPBS ;洗涤液:I X PBS溶液按0.05%的体积比加入吐温-20溶液；阴性对照:将0.1g牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中，得lmg/mL BSA溶液；封闭液:将Ig牛血清白蛋白溶解于IOOmLlXPBS溶液中即得10mg/mL BSA封闭液；底物:用lmg/mL BSA配制所需浓度的ant1-PDGF-BB标准样品溶液；显色剂:10mmol/L氯金酸和2mmol/L氢醌等体积混合；探针:用(IXPBSM)溶液配制1.03nmol/L的适配体修饰的纳米银探针；其中，I XPBSM 配方为 I X PBS 和 lmmol/L MgCl2。(2)将不同浓度的ant 1-PDGF-BB溶液、待测样品和阴性对照在醛基片上点样，37°C条件下固定2h ；(3)每孔加入10~50 μ L封闭液，在37°C条件下封闭I~3小时，用洗涤液荡洗5~15min,洗漆3~4次,拍干；(4)在不同的孔中加入不同浓度的I3DGF-BB标准样品溶液30μ L，在其余的孔中加入30 μ L样品溶液，在37°C条件下反应I小时，用洗涤液荡洗5min，洗涤3~4次，拍干；(5)每孔加入1.03nmol/L适配体修饰的纳米银探针30 μ L,在37°C条件下反应I~3小时，用洗涤液荡洗5~15min，洗涤3~4次，拍干；(6)每孔加入30 μ L显色剂，避光反应I~8min，去离子水冲洗3~4次，拍干；(7)用扫描仪(Scanmaker i900)扫描，LuxScan3.0芯片图像分析软件对图像进行处理，不同浓度的I3DGF-BB标准样品溶液对应不同的灰度值，得到I3DGF-BB标准曲线，由标准曲线计算得到样品中I3DGF-BB的浓度。有益效果:本专利技术的纳米银探针耦合显色剂的方法能大大提高显色检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适配体修饰的纳米银探针，其特征在于，它以直径为10～30nm的纳米银球为内核，银球外表面键合有适配体链和寡核苷酸链；其中，所述的适配体链为：5’?SH?(CH2)6?AAAAAACAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG；其中，所述的寡核苷酸链为：5’?SH?(CH2)6?AAAAAAAAAAAAAAA?3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许丹科，李慧，胡红婷，赵亚菊，董诗羽，羌维兵，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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