利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法。步骤包括：将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，并通过Ni-NTA亲和层析纯化，获得具有一定酶活性的脱氧胞苷激酶。本发明专利技术的有益效果在于经口添食家蚕，使脱氧胞苷激酶dck基因在家蚕体中表达纯化，与人工注射家蚕相比，省时省力提高了生产效率，为家蚕生物反应器产业化提供了技术支撑，并为抗肿瘤药物DCK的研究提供了物质基础，拓宽了杆状病毒表达系统生产人类急需的蛋白药物、基因工程疫苗等领域的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法。步骤包括：将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，并通过Ni-NTA亲和层析纯化，获得具有一定酶活性的脱氧胞苷激酶。本专利技术的有益效果在于经口添食家蚕，使脱氧胞苷激酶dck基因在家蚕体中表达纯化，与人工注射家蚕相比，省时省力提高了生产效率，为家蚕生物反应器产业化提供了技术支撑，并为抗肿瘤药物DCK的研究提供了物质基础，拓宽了杆状病毒表达系统生产人类急需的蛋白药物、基因工程疫苗等领域的应用前景。【专利说明】利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法
本专利技术涉及一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法。
技术介绍
脱氧胞苷激酶(Deoxycytidine kinase, DCK)是人体四大激酶之一,它是催化抗病毒核苷类药物在人体内磷酸化，发挥药效的关键酶。它是一种大小为61KD的磷酸激酶，包括两个30.5KD的相同亚基，是脱氧核苷酸生物合成补救途径中的关键酶，在维持正常的脱氧核苷酸方面起着重要的生理学作用。DCK缺陷与抗病毒和抗肿瘤药物的抗性有重要的关系，它可以激活细胞毒性核苷三磷酸衍生物的活化，在细胞耐药性和药物敏感性方面有着重要的作用。随着核苷类抗肿瘤药物毒性及抗性机理研究的不断深人，将有助于人们开阔思路，设计出疗效更高的新一代药物，从而为肿瘤的研究和治疗作出贡献。DCK类化合物经过十几年的发展，得到了许多高活性的化合物，但由于该类化合物的水溶性差，生 物利用度低，使得该类化合物发展成临床用药进展较慢。前药研究是最有可能将这类化合物发展成药的一个重要方向。研究表明对邪蒿素类似物的不对称双羟化产物进行改造，期望引入氮原子，通过成盐等方法增加化合物的水溶性，进而改善生物利用度。这类化合物具有作用机制独特、活性高、抗耐药性等特点，值得对其进行进一步的研究开发。近年来，Bac-to-Bac杆状病毒表达系统得到广泛应用，该系统根据F因子载体的原理，构建一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid，并且可以快速，同时分离多种重组病毒，有效解决了传统繁琐的空斑分析来筛选重组病毒的难题。该系统具有以下优势:(1)重组率有显著提高，几乎可达100%。(2)大大地缩短了构建重组病毒所需要的时间，使由原来的4一6周或更长减少到仅7 —10天。(3)通过蓝白斑筛选重组病毒有针对性，不会产生野生型和非重组型病毒污染的问题。总之，该技术可以快速、同时产生多种重组病毒。利用家蚕杆状病毒作为表达载体时，应用最多的是将外源目的基因替代polh基因，利用Pph带动目的基因高效表达。产生的重组病毒由于没有多角体蛋白外壳的保护，只能通过皮下注射的方式接种家蚕，导致效率低下，因此可利用双启动子表达载体构建可同时表达dck基因和polh基因的表达载体，获得的重组病毒，可经口接种家蚕，在家蚕幼虫中表达抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶基因dck，并可以经过N1-NTA亲和层析纯化。此方法与人工皮下注射家蚕相比，其优点省时省力，提高了生产效率，便于规模化生产，为家蚕生物反应器产业化提供了技术支撑，并为脱氧胞苷激酶DCK的研究提供了物质基础。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的。一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法，步骤包括:(I)将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到双启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；(2)将上述重组双启动子表达载体转化到DHlOBac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid ；(3)上述Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；(3)上述重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，表达产物通过N1-NTA亲和层析的方法纯化，获得具有酶活性的脱氧胞苷激酶DCK。进一步地,上述步骤(1)双启动子表达载体为pFastBacDual。进一步地,上述dck基因及polh基因分别插入双启动子表达载体pFastBacDual的PplO和Pph的MCS的下游处构建重组双启动子表达载体。进一步地,上述步骤(2)中重组穿梭载体Bacmid是通过将min1-Tn7转座子从双启动子表达载体转位到穿梭载体Bacmid上mini_attTn7祀位点,得到Gen抗性,再通过通过涂布于含有Kan，Gen, Tet, IPTG, X-gal的LB平板上进行蓝白斑筛选，挑选白斑过夜振荡培养，碱裂解法提取获得的。进一步地,上述在步骤(3)中转染试剂脂质体介导是指重组Bacmid及脂质体,分别加入无血清的Bm细胞培养基，将两种溶液混匀，室温静置，另取生长良好的Bm细胞，加入无血清的Bm细胞培养基及重组Bacmid/脂质体复合物，培养一段时间，吸掉上清,加入含有10%血清的Bm细胞培养基，继续培养，观察。进一步地，上述步骤(3)中定量的重组病毒多角体的浓度为2X107NPB/ml。进一步地，上述步骤(3)中重组病毒多角体的添食量为每头蚕8 μ I。进一步地，上述N1-NTA亲和层析纯化是指收集受感染的家蚕血液，超声破碎，离心取上清，与镍离子亲和层析柱结合，用不同浓度的咪唑缓冲液进行洗涤，用IOmM的咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，用250mM的咪唑缓冲液洗脱重组蛋白。本专利技术的有益效果:利用双启动子表达载体，在家蚕Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得的重组病毒，可经口添食家蚕，使抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK基因在家蚕体中表达，与人工注射家蚕相比，省时省力，提高了生产效率。此外表达产物可以进行N1-NTA亲和层析纯化，使获得较高纯度的脱氧胞苷激酶，为抗肿瘤药物的研究提供了物质基础，拓宽了杆状病毒表达系统生产人类急需的蛋白药物、基因工程疫苗等领域的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶dck基因方法的流程示意图；图2为重组双启动子pFastBac Dual表达载体的示意图；图3为dck基因及polh基因表达产物的SDS-PAGE检测示意图；其中M为蛋白质分子标准，I~2分别为经口添食重组病毒的家蚕第六天和第七天的血液，3~4分别为经口添食野生型杆状病毒的家蚕第六天和第七天的血液，5~6分别为正常家蚕第六天和第七天的血液，箭头所指32KD处为DCK条带，29KD处为多角体条带；图4为dck基因表达产物Western-blot检测示意图；其中M为蛋白分子量标准，I为表达产物DCK，2为阳性对照，3为阴性对照；图5为表达产物纯化的SDS-PAGE检测示意图；其中M为蛋白分子量标准，I为洗脱组分，2为洗涤组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，步骤包括：(1)将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到双启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；(2)将所述重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；（3）所述Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；(4)所述重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，表达产物通过Ni?NTA亲和层析的方法纯化，获得具有酶活性的脱氧胞苷激酶DCK。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐家萍，高娟，王文兵，鲍先巡，刘明辉，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：