本发明专利技术公开了人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用，人二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感，采用Walvax-2生产甲肝疫苗，可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲肝病毒纯化疫苗。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用，人二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感，采用Walvax-2生产甲肝疫苗，可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲肝病毒纯化疫苗。【专利说明】人胚肺成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用专利技术所属领域:本专利技术属于疫苗
，具体地说，本专利技术涉及人二倍体成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用，以及人二倍体成纤维细胞株在治疗甲型肝炎病的疫苗中的应用。
技术介绍
: 甲型肝炎(hepatitis A)又被称为甲肝,是由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的肝脏炎症病变为主的传染性疾病，是我国重要的卫生问题。以粪-口传播为主，任何年龄均可患病，但主要为儿童及青少年，病死率低，重症病人多为儿童。HAV属于小核糖核酸病毒科,单列属。无包膜，直径为27nm~32nm, 二十面立体对称的球形颗粒。具有嗜肝性，对环境耐受性强，耐酸、耐热，对20%乙醚及氯仿等不敏感。甲醛、β-丙内脂、高压均可使其灭活。HAV有多个基因型及一个血清型。1978年Provost和Hilleman从绒猴肝脏组织中提取得到HAV，1979年体外培养甲型肝炎病毒成功，至20世纪90年代中期，甲肝减毒活疫苗及甲肝灭活疫苗正式投入生产，甲肝疫苗的研究经历了漫长的时间及无数的实验。到目前为止，甲肝疫苗已经被证实是安全且有效的。全世界每年需要近I亿人份的HAV疫苗，因此需要大规模及高产量的HAV疫苗的生产。我国《中国药典》2010版三部规定“冻干甲型肝炎减毒活疫苗”及“甲型肝炎灭活疫苗(人二倍体细胞)”的细胞培养基质为2BS株及KMB17株或其他经批准的人二倍体细胞株。2BS株及ΚΜΒ17株均为我国自行研制的人源二倍体成纤维细胞，属于贴壁生长细胞。此类细胞生长和正常功能表达的前提条件是附着培养容器表面生长。当生产需要量少时，可采用转瓶、细胞培养瓶等进行培养，但这些培养容器表面积小，培养量少，不利于工业大规模生产。现阶段许多类型的细胞工厂投入疫苗生产，细胞工厂可大量增加培养表面积，提高每个单元的生产能力，并很好的解决细胞贴壁生长及病毒滴度问题。但工业大规模生产仍需要大批量的细胞工厂，高成本限制了其工业生产的扩大及商业开发的潜能。因此经济上，使用生物反应器培养病毒是病毒性疫苗生产的最佳方法。使用微载体的生物反应器培养过程中，微载体为细胞生长提供了大量的表面积，实现了高密度培养，是一个高效的生产系统。该系统可以提供均质的细胞培养环境，更易于细胞稳定的生长及产物的高效表达。脊髓灰质炎及狂犬疫苗的生物反应器培养方式投入生产,证明了此方法在工艺放大时的优势及商业上的潜力。美国专利W095/24468公开了微载体培养MRC-5细胞生产HAV的方法，在细胞-病毒培养物中收获了一定量的甲肝病毒。瑞士专利W02003/049767公布了一种用微载体无血清培养Vero细胞大规模生产甲型肝炎病毒的方法。中国专利CN101406699A公布了一种利用细胞工厂制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的方法。从现有技术来看，无论是MRC_5、2BS或是KMB-17，均在病毒疫苗生产中使用多年，安全性不容置疑。但缺点是细胞未推广使用及细胞代次高，限制了病毒产量的提高和进一步使用。人二倍体成纤维细胞株Walvax-2在中国专利201210371784.X已公开，但此细胞是否对甲肝病毒敏感及是否可利用其生产甲肝病毒疫苗不得而知。
技术实现思路
:本专利技术的一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备甲肝疫苗中的应用，人胚肺二倍体成纤维细胞株对甲肝病毒易感，使用此细胞生产甲肝病毒疫苗可得到一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高、价格低的人用二倍体细胞甲肝病毒纯化疫苗。本专利技术的另一个目的是提供人胚肺二倍体成纤维细胞株在制备治疗甲型肝炎病疫苗中的应用本专利技术公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备甲肝疫苗中的应用。本专利技术还公开了人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2在制备治疗甲型肝炎病的疫苗中的应用。本专利技术的人胚肺二倍体成纤维细胞株在中国专利201210371784.X已公开，为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:C201055，保藏日期是2010年7月13日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话:027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。Walvax-2细胞株对甲型肝炎病毒株敏感，且病毒产量高。将甲肝病毒接种至Walvax-2细胞上，在34~35°C常规培养下，就能生产高滴度的病毒疫苗原液；病毒原液通过抽提、浓缩、纯化、灭活并加入保护剂，就形成甲肝病毒灭活疫苗原液。疫苗原液分装后冻干即为冻干甲型肝炎灭活疫苗。Walvax-2细胞株对现在流行的疫苗株敏感如H2株，YN5株，L-A-1株。在本专利技术中采用的甲型肝炎病毒，为甲型肝炎病毒YN5株，按专利程序要求在2001年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC N0:V200104，此病毒在专利02106985.9中已公开，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心按章索取；人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，CCTCC NO:C201055按专利法要求寄存在中国典型培养物保藏中心，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取；MRC-5 (ATCC CCL171)，W1-38 (ATCC CCL75)登载于美国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。本专利技术中对照细胞KMB-17，2BS登载于中国典型培养物保藏中心的目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。本专利技术中，HAV是指甲肝病毒。采用人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2生产的甲肝病毒灭活疫苗与MRC-5，W1-38，KMB-17，2BS细胞生产的甲肝病毒灭活疫苗相比，本专利技术的优点主要体现在以下几个方面:I)对现用于甲肝病毒灭活疫苗用毒种具有很好的敏感性，适应性，病毒产量高，制成的疫苗免疫原性好。2)人胚肺二倍体成纤维细胞株适应在细胞工厂或生物反应器工艺上或在微载体上进行很好的适应，适合大规模生产和应用。3)人源Walvax-2细胞基质培养HAV，避免了非人源宿主细胞蛋白残留，降低了培养过程中的外源因子污染，疫苗有更高的安全性。4)所制备的疫苗安全性高，免疫效果好，使用方便，纯度高，本专利技术的生产方法制备的甲肝灭活疫苗产生的ED50显著低于GSK的甲肝灭活疫苗。【具体实施方式】下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不能限制本专利技术的保护范围。实施例lWalvax-2细胞株的制备 1.1.实验材料的获得:在获得国家卫生管理部门和伦理委员会的批准后，对捐赠孕妇的夫妇年龄、职业及健康状况，胎儿父母系三代进行调查，选择无肿瘤疾病历史，无先天性异常和遗传缺陷家族史的胎儿。征得胎儿父母及其亲属同意后，签订《捐赠者同意书》。1.2.初代培养:胚胎水囊引产后及时送往实验室，无菌条件下取本文档来自技高网...
【技术保护点】
人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax?2在制备甲肝疫苗中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马波，杨喆，何丽芳，王丽丽，陈敏，王馨，
申请(专利权)人：云南沃森生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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