分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离培养动物骨髓间充质干细胞的方法。该方法包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其中所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。本发明专利技术充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种。该方法包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其中所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-2立方毫米颗粒得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。本专利技术充分利用了骨髓及骨片，处理简单、短时间内可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，是一种方便、快捷、高效的MSC分离培养方法。【专利说明】分罔培养动物骨髓间充质干细胞的方法
本专利技术涉及一种。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。MSC具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。MSC主要来源于骨髓，但在骨髓中，MSC的含量很少，每IO4-1O5 个单核细胞大约含 I 个MSC(Morikawa S，Mabuchi Y, Kubota Y, et al.Prospectiveidentification, isolation,and systemic transplantation of multipotentmesenchymal stem cells in murine bone marrow.J Exp Med.2009.206.2483-2496)。目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的(SoleimanijM.，&Nadri，S.A protocol for isolation and culture of mesenchymalstem cells from mouse bone marrow.Nat.Protoc.2009.4.102-106 ；Sun S，GuoZ，Xiao X，et al.1solation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a noveland reliable method.Stem Cells.2003.21.527-535)。然而该方法获得的 MSC 往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化(Zhu，H.，Guoj Z.K.，Jiang, X.X.，et al..A protocol forisolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.Nat.Protoc.2010.5.550-560 ;Guo，Z.Li，H.，Li，X.，et al.1n vitro characteristicsand in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murinemesenchymal progenitor cells.Stem Cells2006.24.992-1000)。虽然该方法获得的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化(Houlihan，D.D.，Mabuchij Y.，Morikawaj S.，et al.1solation of mousemesenchymal stem cells on the basis of expression of Sca-1and PDGFR- a.Nat.Protoc.2012.7.2103-2111 ；Baddoo Mj Hill Kj Wilkinson R，et al.Characterization ofmesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.J Cell Biochem.2003.89.1235-1249)。虽然这两种方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性。而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这两种方法的广泛应用。因此需要建立一种从骨髓中分离培养MSC的高效方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种获得高纯度和高单位数量(每根长骨得到的MSC)，该方法还具有MSC出现时间早、不需除去骨髓、不需消化、操作简便和快捷的优点。本专利技术所提供的，包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物骨髓间充质干细胞；其中，所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米颗粒(如I立方毫米颗粒)得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。上述方法中，所述长骨由骨干和骨骺两部分组成，表面覆有骨膜和关节软骨，内部为骨髓腔，其中充满骨髓。上述方法中，所述动物可为脊椎动物。所述脊椎动物可为哺乳动物，如小鼠。上述方法中，所述长骨为股骨或/和胫骨或/和来源于前肢骨的长骨。上述方法中，所述离心可为300g_500g离心5-10，如400g离心5分钟。所述缓冲溶液可为使动物细胞保持活性的液体，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。上述方法中，所述动物细胞培养基可为用于贴壁细胞培养的哺乳动物细胞培养基，如MEM培养基、DMEM培养基。在本专利技术的一个实施例中，所述动物细胞培养基为a-MEM完全培养液。上述方法中，所述传代培养可为进行至少2次传代培养，如进行2次传代培养。本专利技术还提供了制备上述用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法。本专利技术所提供的制备用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法，包括:1)将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5-1.5立方毫米颗粒(如I立方毫米颗粒)得到长骨破碎液；2)将步骤I)得到的长骨破碎液进行离心，取沉淀，该沉淀即为用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物。该制备上述用于分离培养动物骨髓间充质干细胞的接种物的方法中，所述动物可为脊椎动物。所述脊椎动物可为哺乳动物，如小鼠。所述长骨可为股骨或/和胫骨或/和来源于前肢骨的长骨。所述离心可为300g_500g离心5-10，如400g离心5分钟。所述缓冲溶液可为使动物细胞保持活性的液体，如0.01M、pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液。实验证明，本专利技术获得的所述动物骨髓间充质干细胞为梭形细胞，表达Seal，⑶44，⑶29，不表达内皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离培养动物间充质干细胞的方法,包括将接种物接种于动物细胞培养基中进行原代培养，再将原代培养得到的细胞进行传代培养，得到动物间充质干细胞；其特征在于：所述接种物为对长骨破碎液进行离心得到的沉淀，所述长骨破碎液是将离体的动物长骨于缓冲溶液中破碎至0.5?2立方毫米颗粒得到的混合物；所述方法不包括用胶原酶消化的步骤，所述方法不除去所述动物长骨的骨髓。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江小霞，毛宁，杨燕美，李红，党瑞杰，张雷，李萍，刘元林，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：