一种奶牛体外性控胚胎的生产方法技术

本发明专利技术是一种制备奶牛体外性控胚胎的方法。本发明专利技术的特点是通过在胚胎培养液内适时加入促进nanog基因表达的小分子化合物vitaminA，从而显著提高了奶牛体外性控胚胎的囊胚率。本发明专利技术对性控胚胎体外的培养条件进行了优化，获得的性控胚胎提高了发育质量，具有理想的妊娠率和适合产业化推广等特点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术是一种制备奶牛体外性控胚胎的方法。本专利技术的特点是通过在胚胎培养液内适时加入促进nanog基因表达的小分子化合物vitaminA，从而显著提高了奶牛体外性控胚胎的囊胚率。本专利技术对性控胚胎体外的培养条件进行了优化，获得的性控胚胎提高了发育质量，具有理想的妊娠率和适合产业化推广等特点。【专利说明】
本专利技术涉及，属于生物与新医药领域，具体方向是现代农业技术。
技术介绍
奶牛体外性控胚胎技术是通过遗传评估、性控精液、卵母细胞采集与成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等结合产生的现代生物技术，对充分利用珍贵的种质资源，加快良种扩繁和牛群遗传改良，提高奶牛业的经济效益具有重要意义。奶牛性控胚胎可通过用性控精液获得，或者对常规胚胎进行PCR法性别鉴定。利用性控精液输精的方法，由于目前商业化的性控精液均为X型精子，性控胚胎后代为雌性，并且利用X精子和Y精子DNA含量的差别利用流式细胞分离技术进行性别控制，存在价格昂贵、效率低、性控精液受精率低和性控胚胎妊娠率低等缺点。通过对常规胚胎进行性别鉴定的方法适合奶牛的育种工作，尤其是种公牛的培育，能提高育种效率。影响性控胚胎质量的因素很多，主要包括卵母细胞分离和体外成熟情况、胚胎培养液成分及比例、胚胎体外培养条件和胚胎冻融的损伤等。影响牛性控胚胎早期发育的一个极其重要的因素是发育阻滞。受精卵分裂的前几个细胞周期中，其合成代谢是由贮存在卵母细胞质中的rRNA和mRNA负责 完成的，在这个时期内，胚胎细胞可以顺利的分裂、发育。随着胚胎的继续发育，合子的基因开始启动转录，其代谢活动逐步由母源mRNA控制转变为合子本身的mRNA控制。在这个过程中，胚胎对所处的环境条件特别敏感，很容易出现发育阻滞现象，发育阻滞出现的时间与合子基因启动的时间有关，牛和羊胚胎发生在8-16细胞期。 目前，体外胚胎的质量与体内胚胎相比仍有较大差距，常出现发育阻滞现象，主要表现为细胞数较少、卵裂球形状不规则、存在死亡的细胞和细胞质碎片、发育速率和抗冻性降低以及酶活性和营养物摄取的改变等方面。体外胚胎生产过程中的精子分离、体外受精、胚胎体外培养和胚胎冷冻保存等过程都可能干扰到配子和胚胎的基因组甲基化水平和乙酰化水平，影响胚胎发育调控基因和受其调控的靶基因的正常表达，这可能是导致IVF胚胎发育阻滞、囊胚率低、流产率高和发育异常的原因之一。在体内，配子的受精和胚胎的发育过程中，基因组DNA不对称的去甲基化、重新甲基化及组蛋白乙酰化修饰转变发生始终存在。然而，体外胚胎的发育过程中，存在高的甲基化水平以及异常的去甲基化水平。因此，体外胚胎基因组异常的甲基化修饰是导致胚胎发育阻滞和迟缓的重要原因。2003年,Chambers I等发现一种新的ES细胞多能性维持因子Nanog,之后的研究证明Nanog在胚胎发育早期特异性表达。Nanog在早期卵裂阶段没有明显的表达，但在桑葚胚时可检测到它的mRNA的存在，nanog基因的表达水平受表观遗传的影响较大，特别是DNA的甲基化可抑制期表达，体外外部环境影响胚胎的表观遗传修饰。而此时的体外胚胎刚好容易发生发育阻滞。我们通过在CRlaa培养液的基础上适时加入能够促进nanog基因表达的小分子化合物vitaminA，从而显著提高了奶牛体外性控胚胎的囊胚率。本专利技术对性控胚胎体外的培养条件进行了优化，获得的性控胚胎提高了发育质量，具有理想的妊娠率和适合产业化推广等特点。
技术实现思路
本专利技术涉及。通过在胚胎培养液内加入vitamin A,促进胚胎的体外发育，到达胚胎体外胚胎培养的理想状态。在体外受精后培养到6-7天时，可以获得发育良好的囊胚。再通过分子生物学方法对胚胎进行性别鉴定。从而获得奶牛的体外性控胚胎。其中，所述哺乳动物为奶牛，胚胎为奶牛胚胎。所述性控胚胎的性别鉴定方法也属于本专利技术的保护范围。【专利附图】【附图说明】图1为CRlaa培养液，培养6-7天，形成的奶牛囊胚。图2为本专利技术该改良的培养液CRlaa+vitamin A，培养6-7天，形成的奶牛囊胚。图3 为胚胎性别鉴定电泳图。M:分子量marker (lkb DNA ladder) ;1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12:检测的胚胎样品编号。【具体实施方式】下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。引物合成和DNA序列测定由invitrogen公司完成。Pencillin-streptomycin 购于 invitrogen 公司。培养用 TCM-199 由 Gibco 公司生产。其他化学试剂除特别指明外，均为Sigma公司生产。培养皿为Nunclon公司产品。RNA提取试剂盒购于Qiagen公司。Pfu DNA扩增酶、克隆载体、胶回收试剂盒购于Transgen公司。克隆载体购于Transgen公司。CRlaa培养液为sigma公司。限制性内切酶购于Takara公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。实施例1，卵母细胞收集 卵巢来自于天津本地的奶牛屠宰场，2小时内将卵巢运输到实验室，运输条件为将卵巢放于灭菌后的0.9%的生理盐水内，含3%的Pencillin-streptomycin抗生素,运输温度为36°C。卵巢运回实验室后进行洗卵操作，在显微镜下对发育良好且由颗粒细胞均匀包被的卵母细胞进行收集。实施例2，卵母细胞的体外成熟收集到的卵母细胞进行含1% Pencillin-streptomycin的PBS溶液冲洗3次。然后放入4孔板培养皿内培养，每孔放入30个卵母细胞，培养液为TCM-199，每孔500培养箱CO2为5%，温度为39°C，培养时间24小时。实施例3，体外受精体外培养成熟的卵母细胞用Hepes清洗2次。用长柄镊子从贮藏罐中取出细管后，直接放入38°C -40°C温水中解冻，全部融化后取出，擦干水，用专用剪刀剪开细管，套上外套管备用。运用上浮法使精子获能。在150ulB0液上覆盖无菌石蜡油形成受精滴，将30-40枚成熟的卵母细胞和2-5X IO6 / ml精子加入到受精滴内，放入CO2箱中共培养18h。实施例4，胚胎培养将获得的受精卵利用PBS冲洗干净后，放于4孔板内分组培养。培养液为CRlaa或CRlaa+vitamin A(IuM),每孔加入培养液Iml, 2天换液一次。实施例5，胚胎性别鉴定与冻存收集到的优良胚胎(见附图1)，分别在显微操作仪下从胚胎内获取单细胞标本，放入标记好的PCR排管内，加入20微升含蛋白激酶K的裂解液进行细胞裂解，裂解程序为水浴55°C，5min,之后水浴95°C，5min。取好标本后的胚胎进行正常冷冻程序冻存，封存于细管内，最终在液氮里长期保存待用。在牛的Y染色体上找到一段性别鉴定片段，利用Primerf软件设计性别鉴定引物一对如下:上游引物:5’-ctagctcgagatgttcagagtattgaacgacgatgt-3’，下游引物 1:5’_gatcgcggccgcttcaatattgaaaataagcac-3’ ),目的片段长度为 690bp (图 3)。PCR扩增条件40个循环，退火温度为65°C，DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种奶牛体外性控胚胎的生产方法。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马毅，姚强，赵庆彬，
申请(专利权)人：天津市奶牛发展中心，
类型：发明
国别省市：